《Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials》：Primary Cell-Based Lymphatic Spheroids in Synthetic PEG Hydrogels: A Scalable Model of Lymphatic Sprouting
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淋巴管（LVs）是淋巴系统的重要组成部分，作为免疫细胞运输的主要途径并维持组织液稳态。LVs在胚胎发育过程中通过淋巴管生成（lymphangiogenesis）形成，在成年期大多保持静息状态，并在炎症等特定情境下重新激活。尽管血管内皮生长因子C（VEGF-C）
淋巴管（LVs）是淋巴系统的重要组成部分，作为免疫细胞运输的主要途径并维持组织液稳态。LVs在胚胎发育过程中通过淋巴管生成（lymphangiogenesis）形成，在成年期大多保持静息状态，并在炎症等特定情境下重新激活。尽管血管内皮生长因子C（VEGF-C）通过VEGFR-3的信号传导是公认的淋巴管生成驱动因素，但支持细胞及微环境力学的影响尚不明确。虽然动物模型对淋巴研究不可或缺，但组织工程系统提供了可重复性、可调控微环境以及原代细胞整合的优势，从而使精确的机制研究和转化应用成为可能。研究人员开发了可重复的球状体模型以在体外重现淋巴管出芽。由原代大鼠淋巴管内皮细胞（LECs）和大鼠淋巴管平滑肌细胞（LMCs）组成的球状体被层粘连蛋白和IV型胶原包被，以模拟集合淋巴管结构。当包埋于10%聚乙二醇（PEG）水凝胶中时，这些球状体形成了稳健的淋巴网络，且VEGF-C补充增强了细胞活力和出芽。为提高转化相关性，研究人员将原代人LECs与成纤维细胞共培养以生成人源球状体，其表现出相似的出芽模式。该球状体平台捕捉了淋巴管出芽的关键细胞和力学特征，为体外重建LV形成提供了自下而上的方法。通过整合原代人细胞，这些模型可适用于患者特异性疾病建模和治疗筛选，为推进淋巴研究提供了多功能且具转化相关性的系统。
淋巴系统是负责将组织间液和大分子回流至血液的单向运输网络，具有维持组织液稳态、促进免疫细胞运输及参与脂质吸收的功能。尽管其在生理和病理过程中作用关键，但出生后淋巴管形成与重塑的机制仍未被完全阐明。这一知识缺口具有直接的转化后果：继发性淋巴水肿（因淋巴管阻塞导致液体积聚的慢性疾病）全球约影响2.5亿人，目前尚缺乏治愈性疗法。近期针对腺病毒介导的VEGF-C基因治疗联合血管化淋巴结移植的II期临床评估，既显示了促淋巴管生成干预的治疗前景，也凸显了在候选化合物进入患者之前对其进行分流的预测性、人细胞来源临床前平台的迫切需求。然而，现有体外淋巴模型在两方面存在局限：其一，多数平台重现的是单层淋巴毛细管而忽视了集合淋巴管（CLVs），后者是具有内层淋巴管内皮细胞（LEC）和外层淋巴管平滑肌细胞（LMC）的收缩性、基底膜包裹结构，恰是淋巴水肿晚期发生病变且为新兴治疗靶向的较大血管；其二，常用于支持LEC出芽的基质（如胶原、纤维蛋白或Matrigel）批次间差异大且对生物化学与力学性质缺乏独立调控，制约了机制研究并影响化合物筛选的可重复性。近期比较分析进一步表明，三维基质中的原代、血管亚型特异性细胞所产生的出芽指标较二维基底上的永生化细胞系更贴合体内淋巴管生成。研究团队此前开发了一种合成水凝胶配方，可支持淋巴管段的长期存活与增殖，为在受控条件下研究出生后淋巴管生成奠定了基础。在此基础上，研究人员旨在构建简化但具生理相关性的模型，以重建集合淋巴管组织的部分特征并实现淋巴管出芽与再生的高通量研究。基于原代细胞的球状体出芽实验相较单层或单纯外植体方法具有三方面优势：自组织三维聚集体更好地重现了体内出芽发生的放射状多细胞几何结构，提供直接对应体内淋巴管生成指标的功能性读数（出芽数量、长度和活力）；与限定性合成基质及96孔板兼容的聚集方式相结合，该平台可扩展至中等通量化合物测试；原代细胞可替换为患者或物种特异性细胞以适配其他淋巴疾病研究问题。为此，研究人员制备了由大鼠肠系膜原代淋巴管内皮细胞和淋巴管平滑肌细胞组成的体外球状体，以层粘连蛋白-胶原包被以模拟CLVs基底膜。1:1的LEC与LMC比例产生力学稳定的球状体，包埋于10% PEG水凝胶中可生成淋巴网络。VEGF-C补充改善了较软基质（6% PEG w/v）中的出芽及较硬基质（12% PEG w/v）中的活力，凸显了该模型以刚度依赖方式对生化信号的响应性。选择LEC:LMC配对旨在构建含衬覆集合血管两种主要细胞的球状体。由于原代人LMCs尚难以从临床标本中获取，研究人员使用人真皮成纤维细胞（HDFs）作为人淋巴球状体模型最接近的替代物。HDFs提供LMCs在体内所供给的血管周围基质支持、ECM分泌及促淋巴管生成因子产生，同时保持平台与人组织来源工作流程的兼容性。在PEG水凝胶中，这些构建体表现出对细胞外基质压缩敏感的出芽行为，突出了淋巴管出芽线索的力学与生化调控之间的相互作用。最后，为评估跨物种适应性和转化潜力，研究人员证明PEG水凝胶支持从淋巴损伤大动物模型分离的羊淋巴管的培养与扩增。总体而言，这些结果建立了一个能够跨物种和组织来源模拟淋巴管出芽的多功能平台。除推进对淋巴管出芽的基础理解外，这些球状体系统为将该体外模型适配于淋巴疾病的精准建模以及个性化医疗和临床前药物筛选的未来应用奠定了基础。该平台的模块化设计——包括原代细胞、限定性PEG基质、96孔板兼容的球状体生成及定量出芽读数——使其能够补充新兴的淋巴芯片和微生理系统。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：从大鼠肠系膜分离原代LECs和LMCs并以1:1或3:1比例在含0.25%甲基纤维素的非组织培养U型底96孔板中自聚集72小时形成球状体，LECs预先以层粘连蛋白-尼多原和IV型胶原包被；以PEG-4MAL大分子单体、含RGD粘附配体和GPQ-W蛋白酶可降解交联肽制备不同浓度（6%–12% w/v）水凝胶并进行流变学表征；采用calcein-AM/TOTO-3活死染色结合共聚焦成像及AngioAnalyzer插件定量出芽总长度、分支数和活力；通过慢病毒转导GFP标记RMLECs进行谱系追踪并以正交切面评估管腔形成；利用纳米压痕测定球状体表面刚度及ElectroForce系统对水凝胶施加压缩力学加载；并从羊淋巴损伤模型（伤后2周和8周，设假手术对照）分离腘淋巴管段在水凝胶中扩增后形成羊球状体，以及从新生儿包皮组织分离人HDLECs和HDFs构建人源球状体。样本来源包括Sprague–Dawley大鼠（n=3，混合样本）、羊（每组n=3）及单一供体人新生儿包皮组织。
3.1 LECs与LMCs自聚集形成球状体：通过明场成像及ImageJ定量面积、周长和圆度发现，混合LEC-LMC球状体形成圆形致密结构，面积显著高于单纯LEC和LMC组，圆度显著高于LEC组；单纯LEC无法形成圆形紧凑结构且移液后解体。
3.2 LECs周围基底膜包被改善混合球状体细胞聚集：通过对比未包被与包被条件发现，层粘连蛋白-胶原IV包被促进LECs聚集形成球状体；包被的LEC-LMC组周长显著降低、圆度显著提高，且包埋于PEG水凝胶后能维持结构并于24和48小时产生出芽，而包被的单纯LEC组包埋后结构解体、细胞弥散。
3.3 PEG水凝胶在含20%血清培养基中促进CLV启发球状体出芽：通过全球状体免疫组化证实层粘连蛋白和胶原IV存在于球状体细胞周围；活死成像定量表明仅在10%和20% FBS条件下出芽，20% FBS组出芽显著高于其他条件且活力显著高于10% FBS和5%血清替代物组，蛋白包被浓度对出芽和活力无影响。
3.4 CLV启发球状体在8%和10% PEG w/v水凝胶中出芽：通过跨6%、8%、10%、12% PEG浓度的活死染色定量发现，6%和12%组无或极少分支且12%组活力显著降低，8%和10%中间刚度组分支长度和活力无显著差异；流变学测得储能模量随大分子单体百分比递增。
3.5 VEGF-C处理挽救6% PEG w/v水凝胶中的出芽表型并改善12% PEG w/v水凝胶中的活力：通过在6%和12%水凝胶中补充10 ng/mL大鼠VEGF-C并进行活死定量发现，VEGF-C显著增加最软6%水凝胶中的分支，并显著提高12%水凝胶中出芽的活力。
3.6 增加CLV启发球状体中LEC数量并不增强出芽：通过比较1:1与3:1 LEC:LMC比例及VEGF-C处理后的活死定量发现，比例和处理对分支和活力均无显著影响；3:1组呈片状生长而1:1组呈放射状出芽；GFP标记RMLECs显示出芽结构具内皮身份，正交切面未见管腔化中空核心。
3.7 应用组织工程策略在体外研究淋巴损伤大动物模型的体内重塑：通过将羊损伤与假手术淋巴管段包埋于10% PEG水凝胶扩增30天后解离计数并形成羊球状体进行活死定量发现，8周组损伤与假手术细胞数相等而2周组假手术细胞数更高；归一化分支长度在2周组显著升高，两时间点假手术组活力均显著更高。
3.8 成纤维细胞是人淋巴球状体形成的必要条件：通过测试HDLECs单独在不同甲基纤维素浓度和蛋白包被下的聚集及与HDFs按6:1、3:1、1:1比例共培养发现，HDLECs单独无法形成球状体，1:1 HDLEC:HDF组形成面积显著更小的圆形紧凑球状体；全球状体免疫荧光显示CD31和VEGFR3阳性，纳米压痕测得中位有效杨氏模量为2449 Pa。
3.9 人淋巴球状体的出芽潜力受细胞外压缩抑制：通过将HDLEC:HDF球状体包埋于10% PEG水凝胶并进行活死定量及3天压缩加载实验发现，对照组中位总分支长度591 μm、中位节点数22、中位活力70%；压缩组总分支长度、节点数和活力均显著降低。
讨论部分总结了该研究建立并表征了跨物种（大鼠、羊、人）的体外淋巴管出芽模型，证实CLV启发球状体在PEG水凝胶中的出芽受生化和生物力学线索引导，中间刚度（8%–10% PEG w/v）最利于稳健出芽，VEGF-C可挽救软基质中的出芽并改善硬基质中的活力，这些结果与基质刚度调控淋巴管形成的既有文献一致；同时指出PEG-4MAL浓度升高同时改变刚度和交联密度，当前设计无法完全解耦这些性质。羊损伤模型提示8周组淋巴细胞的出芽潜力丧失，假手术侧8周较2周出芽增强，提示对侧代偿机制需深入研究。人源模型使用HDLEC与HDF共培养，因原代人LMCs不易获取而以HDFs作为最接近的血管周围细胞替代物。讨论还强调该平台与淋巴芯片等微生理系统互补，具较高通量和较低门槛，可用于化合物筛选和疾病建模；并指出平台缺乏免疫细胞谱系、基质组分有限，出芽定量流程尚未经独立读数交叉验证，且当前培养时长不足以评估管腔形成、未标记RMLMCs以明确各细胞对出芽结构的相对贡献，均为未来研究方向。研究结论为：研究人员引入了球状体淋巴模型作为体外研究淋巴管出芽的手段，并进一步证实PEG水凝胶在组织工程中的多功能性；该PEG水凝胶在离体淋巴管和生物工程体外淋巴模型中均促进淋巴管出芽，是研究淋巴生物学和疾病的适应性平台；PEG水凝胶还可用于动物组织的扩增，羊淋巴损伤模型中分离的淋巴管在水凝胶内增殖并生长出新淋巴出芽长达1个月，提高了高成本大动物研究的细胞产量，未来或可适配患者组织扩增以构建患者特异性淋巴疾病模型；结合脂质纳米颗粒介导的VEGF-C递送进展及VEGF-C基因治疗减少淋巴水肿相关肿胀并改善生活质量的II期临床证据，此类平台有望通过提供预测性、人细胞来源的促/抗淋巴管生成分子读数来加速转化。
