小鼠上丘长程抑制性与兴奋性投射的差异化连接图谱

《Journal of Comparative Neurology》：Distinct Long-Range Inhibitory and Excitatory Projections From the Mouse Superior Colliculus

　　

上丘（superior colliculus, SC）与皮层及皮层下核团广泛连接，参与多种认知与感觉运动功能。SC的传出投射因起源层和拓扑位置而异。本研究鉴定了传出连接的另一决定因素：释放的神经递质。研究人员证明，小鼠间脑、中脑和后脑中的长程GABA能（γ-氨基丁酸能）与谷氨酸能投射神经元产生不同的连接模式。受抑制性vGAT⁺神经元强烈支配的靶区包括外侧背核、连合核、前顶盖前核和红核，以及下丘。受vGAT⁺较弱支配的靶区包括外侧缰核、腹前-外侧复合体和网状核。相反，受兴奋性vGlut2⁺投射强烈支配的靶区包括腹内侧核、束旁核和被盖网状核，而中央内侧板内核以及对侧丘脑和后脑若干核团的支配较弱。在共享的传出靶区中，vGAT⁺与vGlut2⁺投射常支配不同亚区或跨半球连接存在差异，尤其在未定带、中脑周围灰质以及外侧后核、脚桥核、脑桥网状核和被盖网状核中。这些结果共同证明小鼠SC传出连接存在额外维度的复杂性。抑制性投射可能通过多种机制独立于或协同兴奋性投射促进SC介导的功能。未来研究SC长程抑制的功能角色有望阐明这些机制及其对行为的贡献。

**研究背景与问题**

上丘（superior colliculus, SC）是哺乳动物中脑内进化上高度保守的结构，参与多模态感觉运动转换以及注意和决策等认知功能。该核团呈分层结构，由浅层、中间层和深层组成。浅层接收来自视网膜神经节细胞和视觉皮层的拓扑组织视觉信号，在啮齿类动物中，浅层SC是视网膜视觉信息上传至脑其余部位的主要通路。中间层和深层SC包含对多模态感觉刺激做出反应的神经元，并参与启动运动指令。与SC在感觉运动功能中的作用一致，啮齿类SC的特定投射与朝向行为、捕食以及威胁防御反应相关。

SC介导行为的多样性提示该区域在解剖上与众多功能网络相连。事实上，SC广泛支配间脑、中脑和后脑。SC连接性研究表明，传出靶区因SC层次和视网膜拓扑图位置而异。然而，SC投射神经元并非 exclusively 谷氨酸能。已有研究鉴定了起源于浅层的特定长程GABA能投射，但这些研究仅涉及起源于浅层SC的投射和/或表征至特定传出靶区的环路。综上，既往研究提示长程抑制性传递可能是SC传出连接的常见模式，但尚未对SC抑制性投射进行全面的表征。理解SC影响传出靶区的方式对于解析该结构参与感觉运动和认知功能的神经环路至关重要。

本研究的目标是表征SC的所有抑制性传出连接，并将其与兴奋性SC投射直接比较。研究人员使用转基因报告小鼠品系，对SC中的抑制性和兴奋性神经元进行病毒标记，并检查全脑的支配情况。研究人员观察到GABA能和谷氨酸能投射神经元之间不同的传出连接模式。对于被两种细胞类型共同靶向的传出靶区，研究人员发现抑制性和兴奋性投射常支配不同亚区。这些结果阐明了SC传出连接的一个额外层面，可为未来 delineating SC对感觉运动行为通路特异性功能贡献的研究提供信息。

**主要关键技术方法**

研究人员使用vGAT-Cre（品系#028862）和vGlut2-Cre（品系#028863）转基因小鼠（C57BL/6J背景，购自The Jackson Laboratory），这些品系已被证明分别在SC抑制性和兴奋性群体中高特异性表达Cre。使用12–42周龄雌雄小鼠。通过立体定位手术将Cre依赖的顺行病毒（AAV2-Ef1a-DIO-hChR2-mCherry或eYFP）单侧注射入SC以标记vGAT⁺或vGlut2⁺神经元；另采用Cre on/off双标记策略，将AAV2-Syn-FLEX-ChrimsonR-tdTomato和AAV2-Ef1a-FLEX/OFF-hChR2-eYFP共注射入vGAT-Cre小鼠SC，以在同一脑内同时标记vGAT⁺和vGAT^-（推定的兴奋性）神经元。注射四周后灌注固定，制备50 μm冠状切片，进行免疫组化增强荧光信号。部分病例经连续重建并配准至Allen CCF小鼠脑图谱，使用NeuroInfo软件定量标记细胞和轴突，计算各传出区域的轴突终末密度（每立方米的轴突钮扣计数）。支配强度分为"强"（整个核团或局限亚区的密集支配）和"弱"（整个核团或亚区的弥散输入，且在各类病例中一致观察到）。

**研究结果**

**SC抑制性投射**

研究人员使用vGAT-Cre转基因小鼠标记抑制性SC神经元，并使用标准化的脑图谱坐标对标记的vGAT⁺轴突进行全脑分类。在间脑吻侧，丘脑中的vGAT⁺轴突强烈双侧支配连合核，同侧支配外侧背核和中央外侧核。弱或弥散GABA能支配的丘脑靶区包括同侧网状核、腹前-外侧核和腹内侧核，以及腹后复合体、外侧内侧背核和旁中央核。SC GABA能神经元发出强烈的同侧投射至未定带，对侧投射较弱。SC vGAT⁺投射还弥散支配其他同侧前部间脑结构，包括前下丘脑核和外侧下丘脑核。在间脑尾侧，vGAT⁺神经元强烈支配筛核、背外侧膝状核和外侧后核。研究人员还观察到对束旁核、后复合体和腹外侧膝状核的较弱支配，以及对束旁下丘脑核的支配。同侧尾侧丘脑的弥散靶区包括后界核、后三角核、后板内核、膝上核和脚周核。在顶盖前核中观察到强烈的同侧支配，包括视束核、前顶盖前核和后顶盖前核。SC vGAT⁺投射还弥散支配同侧外侧缰核。在尾侧下丘脑中，SC GABA能神经元发出强烈的同侧投射至后下丘脑，对侧投射较弱。vGAT⁺投射还弱支配丘脑底核。抑制性SC vGAT⁺神经元投射至中脑和后脑，在红核、脑桥灰质和中脑周围灰质（尤其是中央和后部切片的侧亚区）中观察到强烈支配，此外还有 parabigeminal 核、矢状核和中脑网状核。在同侧脚桥核和吻侧脑桥网状核以及下丘（尤其是外部皮层）和楔形核中也观察到强烈支配。在含有标记SC vGAT⁺细胞的切片中，研究人员观察到对侧SC的稀疏支配。抑制性轴突还稀疏存在于对侧中脑周围灰质中。受vGAT⁺投射稀疏靶向的同侧后脑传出靶区包括被盖网状核和尾侧脑桥网状核。

**SC兴奋性投射**

研究人员采用相同方法，使用vGlut2-Cre报告小鼠品系标记谷氨酸能SC投射。在吻侧间脑，兴奋性vGlut2⁺轴突弥散支配外侧和 anterior 下丘脑核以及丘脑底核。兴奋性轴突强烈支配同侧中央外侧核、外侧后核和腹内侧丘脑核。在同侧外侧内侧背核、旁中央核和中央内侧核中检测到较弱支配。在同侧未定带中也观察到弱支配。SC兴奋性投射还延伸至对侧，弱支配中央外侧核和腹内侧丘脑核。在尾侧间脑，SC投射强烈支配同侧外侧后核、束旁核和筛核，以及背外侧膝状核。在丘脑的后复合体和腹后复合体中检测到较弱同侧支配。其他弱支配的尾侧丘脑核包括同侧腹外侧膝状核、膝上核、束旁下核、后界核、后三角核和脚周核。还观察到对同侧后下丘脑核的弱支配。弱靶向的对侧传出靶区包括束旁核和外侧后核。在顶盖前区，SC兴奋性神经元强烈支配视束核和后顶盖前核，并较弱投射至后连合核、前顶盖前核和橄榄顶盖前核。谷氨酸能SC神经元支配中脑和后脑核团。vGlut2⁺轴突强烈支配同侧 parabigeminal 核和矢状核，以及脑桥灰质、中脑网状核和楔形核。SC兴奋性投射弱投射至同侧中脑周围灰质的中央和后部切片，尤其是侧亚区。研究人员还观察到对下丘外部皮层的极弱同侧支配。在含有标记SC vGlut2⁺胞体的切片中，研究人员观察到对对侧中脑周围灰质和SC的弱轴突支配。兴奋性SC神经元发出强烈且完全对侧的投射至被盖网状核。研究人员还发现vGlut2⁺投射双侧支配脚桥核和脑桥网状核（吻侧和尾侧亚区）。在这些核团中，对侧投射主要局限于内侧区域，而同侧投射靶向侧区。

**SC抑制性与兴奋性投射的比较**

为直接检查同一脑中两种神经元群体的传出靶向，研究人员采用了Cre on/off双标记策略。将两种表达荧光团的病毒共注射入vGAT-Cre小鼠SC：一种病毒在所有表达Cre的（vGAT⁺）细胞中表达tdTomato，另一种病毒在所有不表达Cre的（vGAT^-）细胞中表达eYFP。该方法使研究人员能够在同一脑中标记抑制性和推定的兴奋性SC投射神经元。双示踪剂方法产生的轴突模式与单示踪剂病例的报道发现一致。在前部丘脑，研究人员发现vGAT⁺细胞 exclusively 支配同侧网状核和外侧背核。vGAT⁺细胞强烈投射至连合核的全部，而推定的兴奋性vGAT^-细胞仅弱靶向该核的最尾侧切片。相反，vGAT^-细胞而非vGAT⁺细胞强烈支配旁中央核、中央内侧核和腹内侧核。更后部的间脑切片揭示了两种SC神经元群体的不同支配模式。在外侧后核中，vGAT⁺细胞优先靶向内侧区域，并向外侧弥散支配。相反，vGAT^-细胞发出高度局限的投射至该核的侧区。此外，vGAT^-投射至外侧后核在更后部切片中显得相对更密集，而vGAT⁺标记纤维未观察到这一现象。vGAT^-而非vGAT⁺ SC细胞还发出对侧投射至该丘脑核。研究人员还发现未定带支配的差异。vGAT⁺细胞支配该核的整个吻尾轴，并更强靶向腹侧层。相反，推定的兴奋性vGAT^-细胞倾向于在更尾侧切片中支配未定带的背内侧亚区。在顶盖前区，兴奋性和抑制性SC投射通常显示相似的支配模式。然而，研究人员在前顶盖前核中观察到显著差异。vGAT⁺ SC细胞发出强烈投射，支配该核的大部分，但背侧最密集。相反，vGAT^-投射弥散靶向沿背侧边界的有限部分。研究人员还观察到仅vGAT⁺细胞投射至中脑红核。两个群体均支配对侧SC；然而，研究人员发现vGAT^-轴突主要支配中间层的更侧亚区，而vGAT⁺终末也存在于内侧中间层。在脑桥中，两个SC群体显示汇聚和发散支配模式。在吻侧脑桥网状核中，两种投射支配相似的岛侧亚区；然而，vGAT^-终末还支配该核对侧（优先在更内侧区域）。在尾侧脑桥网状核中观察到相似模式。研究人员发现两个SC群体均局灶性支配同侧脑桥灰质的侧亚区，且vGAT^-细胞提供额外的、更弥散的输入至该核更内侧区域。被盖网状核由vGAT⁺投射同侧支配，由vGAT^-终末对侧支配。最后，研究人员观察到vGAT⁺细胞支配下丘的全部，尤其强烈投射至外部皮层。相反，该核基本缺乏vGAT^-细胞的输入，除了外部皮层侧缘的极弱终末。总之，Cre on/off双标记策略的使用与研究人员使用vGAT-Cre和vGlut2-Cre报告品系发现的总体支配模式一致。更重要的是，该方法验证了抑制性和推定的兴奋性投射之间的支配模式差异可从SC的同一区域观察到。

**讨论与结论**

本研究鉴定了SC GABA能和谷氨酸能投射神经元的不同传出支配模式。部分靶区仅由一种群体支配。外侧背核和网状丘脑核、外侧缰核和红核 exclusively 由抑制性vGAT⁺细胞靶向。相反，兴奋性vGlut2⁺ SC细胞单独支配中央内侧板内核丘脑。其他传出靶区被两个群体不等靶向。下丘和未定带以及连合核、前顶盖前核和后下丘脑核接受vGAT⁺细胞的密集输入和vGlut2⁺细胞的弱或局限支配。相反，束旁板内核和腹内侧丘脑核接受vGlut2⁺而非vGAT⁺神经元的强烈输入。研究人员还发现SC vGlut2⁺群体更常发出跨半球投射至丘脑和脑桥的传出靶区。至共享传出靶区的投射常显示不同的表达模式。例如，vGAT⁺和vGlut2⁺神经元支配未定带和外侧后丘脑的不同亚区。总之，这些结果表明长程抑制性投射是SC传出连接的主要且独特组成部分。

关于SC抑制性神经元，研究人员使用vGAT报告品系标记小鼠SC中的所有抑制性神经元。其他表征浅层SC抑制性投射的研究使用GAD67或GAD2转基因品系。在浅灰层中检查发现，仅60%的GABA能细胞表达GAD67，且很可能是中间神经元。相反，GAD2⁺浅层SC细胞被证明投射至外侧膝状核和parabigeminal核，而位于腹侧层的细胞支配顶盖前区。GAD2⁺可能涵盖不同的神经元群体。来自浅层SC至外侧膝状核和parabigeminal的GAD2⁺投射起源于接受独特传入输入的不同群体。类似地，vGAT由形态和分子标记各异的异质性GABA能细胞类型集合表达。虽然抑制性神经元传统上以水平胞体树突轮廓识别，但SC GABA能神经元 exhibit 一系列形态学特性。水平细胞仅占浅灰层中表达GAD2细胞的25%和中间SC中表达GAD67细胞的10%。单细胞测序技术通过鉴定具有独特RNA表达谱的群体进一步阐明了SC中抑制性神经元群体的多样性。使用对这些分析发现的GABA能亚型具有选择性的转基因小鼠品系可能揭示在vGAT或GAD报告品系中被掩盖的选择性传出通路。例如，位于浅层SC的表达Pax7的GABA能细胞仅支配腹外侧膝状核。评估分子定义的亚型（抑制性和兴奋性群体）可能进一步阐明SC传出投射的组织，并有助于识别特定行为角色。

关于长程抑制性功能基序，SC GABA能投射与行为相关。浅层SC中离散的GAD2⁺细胞群体支配外侧膝状核和parabigeminal核；这些通路分别促进对视觉 looming 的冻结和逃跑反应。鉴于SC在上升和下降视觉通路中的既定作用，至视觉和朝向相关区域（即外侧膝状核、外侧后核、顶盖前核和脑桥核）的抑制性投射可能调节对视觉刺激的反应。此外，本研究揭示了若干看似非视觉相关的核团主要受SC抑制性投射支配。例如，外侧背核和连合核丘脑核通过其与边缘系统的连接与学习和记忆相关。SC至这些区域的 exclusively GABA能输入如何促进边缘功能仍有待确定。类似地，至前顶盖前核（与镇痛相关的区域）的强烈抑制性投射的发现提示SC调节疼痛感知的可能性。除了提供直接前馈抑制外，长程GABA能投射还可能促进前馈去抑制。丘脑 largely 缺乏抑制性中间神经元，依赖GABA能传入进行抑制控制。丘脑抑制的已知贡献者包括未定带、丘脑网状核、前顶盖前核和脑桥网状结构。研究人员发现SC vGAT⁺细胞支配这些丘脑抑制来源，提示SC在解剖上处于去抑制丘脑核团的有利位置。在SC内，抑制性信号由GABA能中间神经元和来自若干间脑和中脑核团的外源性抑制输入共同提供。SC GABA能投射至这些传入靶区可能为SC提供门控或抑制抑制性输入的机制。腹外侧膝状核和腹侧未定带均与SC有相互GABA能连接。这些SC传入靶区与对预期视觉威胁的防御反应和朝向行为相关。SC对这些核团的抑制可能阻断对自身的抑制性输入，有效提供内部驱动的去抑制手段。鉴于SC是上升和下降视觉通路的中心节点，这种机制可能赋予SC改变对威胁（或奖赏）相关视觉线索的刺激-反应行为偶联的手段，而非作为自上而下运动指令的被动中继。这种相互GABA能环路安排还可能促进对感觉刺激的神经元习惯化的调节。腹外侧膝状核支配内侧SC，而未定带至SC的输入沿吻尾轴拓扑组织，并沿内侧-外侧轴反向组织。鉴于SC本身具有视网膜拓扑组织，SC驱动的对这些抑制性输入的选择性抑制可能选择性地增强SC对不同视野区域的反应。SC兴奋性和抑制性投射对间脑、中脑和后脑的广泛支配预设了两种神经递质系统之间某种协调组织方式。在后脑中，研究人员观察到SC vGAT⁺细胞同侧支配和vGlut2⁺细胞对侧支配的一致安排。这两种投射驱动互补的朝向运动。在其他区域，研究人员观察到共享传出靶区靶向的差异。例如，SC抑制性细胞投射至外侧后丘脑核的内侧区域，而兴奋性SC投射支配该核的侧区。尽管尚未鉴定与SC支配这些差异一致的具体行为功能，但有证据表明该核的解剖连接存在亚区差异。然而，在许多核团中，研究人员观察到两种投射类型的重叠支配模式。这些SC输入可能突触到给定核团内的不同群体上。或者，SC抑制性和兴奋性投射神经元可能以情境或状态依赖的方式不同地放电，为SC提供双向调节传出活动的机制。

关于方法学考虑和未来方向，研究人员的手术方法旨在标记SC各层的大量神经元而不扩散至皮层或其他中脑结构。因此，本研究主要追踪起源于中央SC中间层和深层的投射。一些传出靶区由仅位于SC更内侧或更外侧区域的投射神经元靶向，这些区域可能未在本研究病例中体现。例如，研究人员在斜方体核和丘脑室旁核中观察到弱且不一致的轴突标记，这些区域由内侧SC支配。类似地，研究人员仅观察到对腹侧被盖区和黑质致密部的极弱支配，这可能起源于SC内侧或浅层的投射神经元。注射靶向的变异结合较小的样本量对解释本研究观察到的支配模式构成挑战。未来在感兴趣的传出靶区采用逆行追踪的研究可用于验证和进一步表征SC投射连接。先前的追踪研究将SC至背外侧膝状核的投射描述为终止于壳亚区。虽然研究人员在后部切片中观察到来自vGAT⁺和vGlut2⁺群体的相似支配模式，但研究人员还发现两种投射均向腹内侧下行以靶向前部切片的核亚区。虽然这不是此类发现的首次报道，但未来工作需要验证这种核靶向输入的来源。SC各层的组织方式使得视网膜信号和视觉皮层输入通过浅层中继，而深层整合多模态感觉信号并参与下降运动通路。识别哪些层对给定传出投射有贡献将有助于阐明行为功能。这可能在未来的研究中使用层特异性报告品系来实现。Cre on/off病毒载体允许在同一组织中直接比较双群体，是用于由两个分子不同的神经元群体组成的核团（如SC）的理想选择。该方法使研究人员能够确认vGAT⁺和vGlut2⁺投射在未定带和外侧后丘脑核中的不同亚区支配模式。然而，转基因品系中Cre重组酶表达的效率并不完全。因此，在解释vGAT^-标记的投射结果时需要谨慎，因为该群体可能包括一定比例未能表达Cre的GABA能细胞。"Cre off"病毒转染也较不稳健，导致转染群体大小不等。因此，研究人员使用Cre on/off病毒构建体是为了补充和验证使用传统单群体标记方法获得的结果。本研究的技术方法无法深入了解传出靶区之间侧支化的普遍程度。例如，投射至未定带的GABA能SC神经元是否也支配丘脑或中脑？确定传出组织的这一方面将告知哪些环路可能被共同募集以促进特定行为功能。投射至对侧脑桥网状结构（根据本研究发现可能是谷氨酸能）的SC神经元被发现还支配板内核丘脑以及其他间脑和中脑靶区。使用逆行腺相关病毒或伪狂犬病毒标记方法可有助于识别特定SC投射的侧支靶区。研究人员的发现表明GABA能神经元是小鼠SC传出连接的主要来源。尚不确定这一特征是否存在于其他哺乳动物物种中。一个研究组在猫的SC神经元群体中鉴定了投射至外侧后丘脑核的推定抑制性水平细胞。在更高阶物种如雪貂或灵长类中的解剖追踪研究将有助于确定长程抑制性投射是否是SC连接的进化保守元件。

结论：长程抑制性投射神经元是小鼠上丘传出连接的主要贡献者。vGAT⁺ SC神经元支配间脑、中脑和后脑的一系列核团。将该投射与谷氨酸能vGlut2⁺神经元的投射进行比较，揭示了复杂的支配模式安排。虽然一些传出靶区被一种投射不成比例地靶向或表现出亚区定位差异，但其他核团显示相似的支配模式。两个SC群体还表现出独特的跨半球投射。未来工作需要 delineating 这两个群体及其投射模式对特定神经功能和行为输出的贡献。