《Microbiological Research》：A global survey of type I secretion systems and the substrates in Gram-negative bacteria
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摘要I型分泌系统（T1SS）是革兰氏阴性细菌所使用的一种特殊装置，它仅包含三个组成部分，但能够介导蛋白质通过两个细胞膜的运输。尽管这些成分功能重要，然而革兰氏阴性细菌中T1SS的真实分布和多样性仍然不清楚。在这项研究中，我们首先对50组具有实验验证功能的T1SS进行了注释和聚类，
摘要 I型分泌系统（T1SS）是革兰氏阴性细菌所使用的一种特殊装置，它仅包含三个组成部分，但能够介导蛋白质通过两个细胞膜的运输。尽管这些成分功能重要，然而革兰氏阴性细菌中T1SS的真实分布和多样性仍然不清楚。在这项研究中，我们首先对50组具有实验验证功能的T1SS进行了注释和聚类，然后使用基于同源性的检测策略结合基因组组织分析，对2996个代表性细菌菌株的基因组中的T1SS进行了全面筛查。总共，在2037个菌株中发现了4967组高度可信的T1SS，涵盖了13个门、357个属和901个种。这些T1SS被分为九个簇，其中沙门氏菌
引言 I型分泌系统（T1SS）仅在革兰氏阴性细菌中发现。已在多种物种的分离株中发现，包括大肠杆菌 （Hess等人，1986年）、肠沙门氏菌 （Morgan等人，2007年）、铜绿假单胞菌 （Zhao等人，2019年）和鲍曼不动杆菌 （Wiradiputra等人，2025年）等，并且在耐药菌株中尤为丰富（Yang等人，2023年）。据报道，多个T1SS底物与细菌的基本生存过程相关，例如环境适应（例如LapA调节生物膜的形成和扩散（Smith等人，2018a））、营养获取（例如HasA捕获铁）（Kanonenberg等人，2013年）、毒性（例如PnxIA诱导红细胞裂解（Sasaki等人，2009年）以及粘附和定植（例如SiiE促进细菌进入宿主细胞（Li等人，2025年））。
T1SS是一种单向分泌装置，能够快速有效地将底物从细胞质运输到细胞外环境。T1SS的组成相对简单。其典型组成部分包括一个内膜蛋白（IMP）、一个周质适配器蛋白（PAP）和一个外膜蛋白（OMP）通道，形成一个三部分的外排泵。IMP是一种ATP结合盒（ABC）转运蛋白，能够特异性识别底物的分泌信号（Holland等人，2005年），并通过ATP水解驱动其分泌（Rees等人，2009年）。PAP在底物结合时通过可逆的构象变化连接系统的内膜和外膜组成部分（Thanabalu等人，1998年）。OMP通常为TolC或其同源物，其特征是β-桶状结构，锚定在外膜上，形成一个长管状通道，使底物能够穿过膜（Alav等人，2021年）。虽然这三个组成部分协同工作且在分泌过程中都是不可或缺的，但它们之间并不表现出严格的一一对应关系。IMP-PAP复合物通常表现出更强的系统特异性，而OMP可以与其他IMP-PAP复合物结合（Abby等人，2016年），甚至可以与不同于T1SS的跨膜系统共享（Jang，2023年）。值得注意的是，这种三部分结构并不是T1SS所独有的。根据内膜转运蛋白的类型，革兰氏阴性细菌的三部分外排系统被分类为Major Facilitator Superfamily（MFS）、Resistance-Nodulation-Division（RND）和ABC超家族，T1SS属于ABC超家族的一个特定亚型（Alav等人，2021年）。已经鉴定出许多T1SS，其中HlyBD（Hess等人，1986年）、HasDEF（Binet和Wandersman，1996年）、CvaAB（Gilson等人，1990年）和LapEBC（Hinsa等人，2003年）是研究较为深入的代表性例子。这些分泌系统在序列及其组成基因的基因组组织上表现出显著差异，突显了T1SS的多样性。
到目前为止，我们对控制T1SS的转录调控机制的理解仍然有限。在肠沙门氏菌 中，沙门氏菌 致病岛（SPI）-4编码的T1SS（SiiCDEF）与SPI-1 T3SS（Yu等人，2025年；Main-Hester等人，2008年）共表达，而由SPI-9编码的另一组T1SS（BapABCD）则受全局调节因子RpoS（Velásquez等人，2016年）和CsgD（Latasa等人，2005年）的控制。在大肠杆菌中，溶血素hlyCABD操纵子的转录依赖于与NusG相关的蛋白RfaH（Leeds和Welch，1997年）。在肺炎杆菌 中，氧化应激调节因子OxyR抑制其ApxIBD T1SS的表达（Guo等人，2024年）。证据普遍支持T1SS的转录整合到全局调控网络中，而不是由独立的专用调节因子控制。
T1SS的底物蛋白被称为T1SPs，它们通常具有C端的RTX（Repeats in ToXin）结构域和信号序列特征（Kanonenberg等人，2013年）。虽然非典型的T1SPs可能具有相似的特性，但它们的N端模块中存在一个用于切割细菌转谷氨酰胺酶样半胱氨酸蛋白酶的位点，这要求它们在分泌前必须经过周质中间体的处理（Smith等人，2018b）。早期的研究基于序列特征预测了大量T1SP候选蛋白。例如，Linhartová等人（2010年）结合了基序扫描、HMM分析和RPS-BLAST工具来筛选T1SPs，在840个细菌基因组中生成了1024个候选RTX蛋白。近年来，机器学习算法和大型语言模型（LLMs）的引入和优化推动了多种T1SP预测工具的发展，如T1SEstacker（Chen等人，2022年）、DeepSecE（Zhang等人，2023年）、PLM-Effector（Zheng等人，2026年）和MoCETSE（Shi等人，2026年），这些工具有效促进了新T1SPs的发现。尽管这些工具预测出了大量的T1SP候选蛋白，但最近对沙门氏菌 T1SSs的研究表明，单个细菌基因组中的T1SP实际拷贝可能相当有限，并且它们的编码基因往往位于与T1SS成分编码基因紧密相邻的位置（Yu等人，2025年）。目前仅依赖序列特征的模型容易产生高比例的假阳性结果。
在这项研究中，我们手动整理了经过实验验证的功能性T1SS及其底物蛋白，以表征它们的进化特征。在这个基础数据集的基础上，我们系统地识别了数千个代表性革兰氏阴性细菌基因组中的新T1SS和T1SP候选蛋白，以研究它们的分布和进化。最后，基于扩展后的高可信度T1SP数据，我们训练了一个新的基于Mamba的模型，该模型能够有效预测T1SPs，其性能优于现有的最先进模型。利用新模型，我们识别并观察了T1SPs在革兰氏阴性细菌中的分布。
章节片段 验证的功能性T1SS的聚类 讨论 T1SS是革兰氏阴性细菌中一种重要的蛋白质分泌系统，在各种生理过程中发挥着重要作用。在这项研究中，我们系统地研究了约3000个代表性细菌菌株的蛋白质组中T1SS及其底物蛋白的分布和进化。令我们惊讶的是，T1SS的分布非常广泛。总共在2037个菌株中发现了4967组高度可信的T1SS，涵盖了13个门
经过实验验证的功能性T1SS及其对应的T1SPs https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) 。对于每个功能性T1SS，我们进一步注释了以下信息：组成基因和经过实验验证的底物基因、这些基因的核苷酸和肽序列、细菌宿主信息：
未引用的参考文献 (Angara等人，2024年；Beltagy等人，2020年；Blum等人，2009年；Braet等人，2022年；Liang等人，2024年)
CRediT作者贡献声明 Jialin Li： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原草案，可视化，形式分析，数据整理。Xin Cao： 撰写 – 审稿与编辑，形式分析，数据整理。Jiaxi Chen： 撰写 – 审稿与编辑，形式分析，数据整理。Jiamin Wu： 形式分析，数据整理。Mingyang Yu： 形式分析。Yiwei Wang： 撰写 – 审稿与编辑，软件。Weimiao Kong： 撰写 – 审稿与编辑，数据整理。
