《Microchemical Journal》：HPLC-MS/MS enantiomeric profiling of amino acids in honey for authentication and traceability using a dilute-and-shoot strategy and a teicoplanin-based chiral stationary phase
编辑推荐：
蜂蜜富含来源于多种途径的营养物质，每种来源均留下可用于质量评价与溯源的指纹特征。蜂蜜含有碳水化合物、蛋白质、氨基酸（AAs）、维生素、酚类化合物、植物化学物、矿物质及其他微量营养素。然而，这些营养物质可能来源各异。蜜蜂采食的花在植物学与地理来源上存在差异，即使
蜂蜜富含来源于多种途径的营养物质，每种来源均留下可用于质量评价与溯源的指纹特征。蜂蜜含有碳水化合物、蛋白质、氨基酸（AAs）、维生素、酚类化合物、植物化学物、矿物质及其他微量营养素。然而，这些营养物质可能来源各异。蜜蜂采食的花在植物学与地理来源上存在差异，即使同一植物物种的单花蜜也会表现出变异，因为生长于不同环境的植物具有不同的化学与微生物特性。此外，蜂蜜组成不仅反映植物来源化合物，也反映蜂源成分，包括蜜蜂自身的酶与微生物残留，以及人工饲喂的贡献。这些多样来源塑造出独特的化学模式，日益被探索作为质量控制、掺假检测、溯源与真伪鉴别的生物标志物。然而，这种复杂多变的组成也使蜂蜜成为最常被掺假的食品之一。因此，寻找特异、稳定且具来源信息量的指纹对可靠的真伪评价至关重要。在蜂蜜的营养物质中，氨基酸对映体（AAEs）尤其具有信息价值。对映体在常规非手性MS/MS条件下通常表现出相同的碎裂行为，其分布特征对分析条件的微小差异敏感。重要的是，AAEs并非恒定，而受其生物学来源及加工因素（包括贮藏条件）塑造。氨基酸是蜂蜜的组成成分，其手性为其化学、物理与生物活性增添了一层特异性，使其在食品化学、营养学与代谢中具有关键作用。结构上，氨基酸由连接于α-碳上的氨基（-NH2）与羧基（-COOH）定义，除甘氨酸外所有蛋白质源性氨基酸均具有手性。侧链可变性决定其极性、疏水性及反应性，可分类为脂肪族、芳香族、极性不带电、带正电与带负电组。蜂蜜中已检出超过26种游离氨基酸，其中脯氨酸最为丰富，并被广泛认为是成熟度与真伪的标志物。其他氨基酸如羟脯氨酸（Hyp）与瓜氨酸（Ctr）也对其营养与生化特征有所贡献。氨基酸组成随地理位置、花源、贮藏与加工而变化。手性进一步区分氨基酸，因为D-与L-对映体在物理、化学与生物性质上不同，进而影响蜂蜜的营养与功能品质。天然食品基质中以L-氨基酸为主，D-氨基酸可源于加工、贮藏、酶活性或微生物代谢。由于蜂蜜中的氨基酸来源于花蜜、花粉与蜜蜂，并可能受微生物代谢影响，其对映体分布提供了与植物学及地理来源相关的独特化学指纹。因此，氨基酸对映体分析具有双重优势：既捕捉蜂蜜的天然生化组成，又同时检测可能损害蜂蜜真伪的偏差。复杂食品基质（如蜂产品）中氨基酸的分析测定已采用多种方法，主要基于气相色谱-质谱（GC-MS）与高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV），包括直接与间接模式，尽管核磁共振与电动色谱在某些情况下也有应用。高效液相色谱（HPLC）因高灵敏度而成为复杂基质中应用最广泛的方法之一，尤其与荧光检测（FLD）或二极管阵列检测（DAD）联用时。然而，这些方法通常需要用邻苯二甲醛与9-芴基甲基氯甲酸酯等试剂衍生化，或使用新型衍生化试剂以实现非生色团氨基酸的检测，使工作流程在分析上要求高且耗时。质谱（MS），尤其串联质谱，因在蜂蜜等挑战性基质中可提供高灵敏度且样品制备极少，对痕量分析日益具有吸引力。固定相的最新进展拓展了无需衍生化直接对映分离的机会。应注意，无需衍生化直接测定AAEs具有若干重要优势，包括简化样品制备、缩短分析时间、降低试剂与溶剂消耗，以及减少与衍生化反应相关的实验变异来源（如转化不完全、副反应或衍生物不稳定）。此外，直接手性分离保留分析物的天然化学结构，可促进方法自动化与高通量分析，同时代表一种更可持续的方法，符合绿色分析化学（GAC）与白色分析化学（WAC）原则。因此，手性固定相的发展使游离氨基酸（FAAs）的直接对映分离日益可行，为基于手性衍生化的传统间接方法提供了有吸引力的替代方案。α-与γ-环糊精、手性奎宁衍生物、离子交换材料与大环糖肽等手性选择剂利用氢键、π-π相互作用与空间效应区分D-与L-对映体。其中，替考拉宁等大环糖肽尤其受到关注，商品化色谱柱（如Chirobiotic? T、T2、TAG）广泛用于对映分离。替考拉宁的近期修饰进一步增强了对氨基酸的手性分离，使该固定相成为分离AAEs的有吸引力选择。关于蜂蜜中氨基酸测定的样品制备技术，基于样品在水或含0.1%甲酸的水中稀释的简单流程常被使用，因其简便、低成本且符合GAC与WAC的若干原则。事实上，近年来多种稀释-直接进样策略已应用于蜂蜜中氨基酸的靶向分析或记录蜂蜜化学指纹。该流程提供简单易操作的方法，使用合适溶剂将分析物萃取至液相，随后在测定前稀释。适当稀释可降低基质效应并简化整体流程。为促进样品溶解，超声浴与涡旋振荡均已被采用。某些情况下也采用离子交换技术预浓缩氨基酸，以及固相萃取（SPE），尽管后者因流程复杂、成本高与回收率低而逐渐失去兴趣。因此，本研究的主要目标在于开发一种简单、直接且稳健的分析策略，用于蜂蜜中游离氨基酸的对映体测定，解决先前报道方法的若干局限（衍生化、基质效应、未针对不同植物来源优化/验证等）。尽管蜂蜜中氨基酸谱分析已被广泛研究，但大多数方法集中于总氨基酸浓度，而提供对映体信息的方法往往在色谱分离前涉及繁琐的样品制备、预浓缩和/或衍生化流程。相比之下，本研究旨在实现无需衍生化的AAEs直接测定，从而简化样品制备、缩短分析时间、减少试剂消耗及与衍生化反应相关的潜在变异来源。该方法对蜂蜜这一复杂高糖基质尤为相关，并提供无法从常规非手性谱分析获得的氨基酸组成互补信息。在此背景下，本研究目标为：（i）遵循GAC与WAC原则，开发并优化尽可能简单快速的样品处理，以获得良好回收率并尽可能降低基质效应；（ii）开发并优化无需衍生化、同时分离与测定蜂蜜中游离AAEs的直接色谱方法；（iii）依据现行指南及两项分析指标（蓝色适用性等级指数-BAGI；紫色创新等级指数-VIGI）评估并验证其分析性能；（iv）评估该方法对表征不同来源（植物学与地理）蜂蜜样品的适用性；（v）通过统计分析探究D/L氨基酸谱为蜂蜜表征与质量评价提供互补信息的潜力。
研究背景与问题提出
蜂蜜的营养物质来源多样，其组成既反映植物来源化合物，也反映蜂源成分及人工饲喂贡献，这种复杂性使其成为最常被掺假的食品之一，因此寻找特异、稳定且具来源信息量的指纹对可靠真伪评价至关重要。氨基酸对映体（AAEs）因其分布受生物学来源与加工贮藏因素塑造，且对映体在常规非手性MS/MS条件下碎裂行为相同，被视为特别具信息价值的标志物。然而，现有蜂蜜氨基酸分析方法多集中于总氨基酸浓度，提供对映体信息的方法往往需衍生化、预浓缩或固相萃取（SPE），流程繁琐、耗时、成本高且回收率低；基于HPLC-UV/FLD/DAD的方法则常需邻苯二甲醛、9-芴基甲基氯甲酸酯等衍生化试剂，分析要求高。串联质谱（MS/MS）虽灵敏度高、样品制备少，但直接对映分离仍依赖手性固定相的进步。基于此，研究人员旨在开发一种无需衍生化、简单直接的蜂蜜游离氨基酸对映体测定策略，以简化样品制备、缩短分析时间、减少试剂消耗与衍生化相关变异，并提供常规非手性谱分析无法获得的互补信息。
研究内容与结论
研究人员建立了基于稀释-直接进样（dilute-and-shoot）样品处理与替考拉宁（teicoplanin）手性固定相的HPLC-MS/MS方法，用于蜂蜜中氨基酸对映体的同时分离与测定，并按现行指南及BAGI、VIGI指标完成验证。结论表明：该方法可在约40 min内实现18种氨基酸对映体的完全分离（His未达对映分离）；样品处理仅需水溶解、涡旋、离心、过滤与甲醇稀释，无需衍生化、SPE或预浓缩；方法精密度高（%RSD均低于10%）、灵敏度好（LOD 2–100 μg/kg，LOQ 6–340 μg/kg）、回收率满意（86%–113%），基质效应在?16%至+13%之间；AAEs谱可区分植物学与地理来源。其重要意义在于为蜂蜜真伪鉴别与溯源提供了一种简单、直接、稳健且符合绿色与白色分析化学原则的分析工具。
关键技术方法
研究采用稀释-直接进样策略处理蜂蜜样品：称取1 g匀质蜂蜜以10 mL水涡旋溶解2 min，12000 rpm离心5 min去除颗粒物，上清经0.45 μm滤膜过滤，取0.5 mL滤液与甲醇1:1（v/v）混合并加入内标DL-Ala-d4（0.1 mg/L）后进样。分离在Astec? Chirobiotic? T2色谱柱（10 cm×2.1 mm，5 μm，替考拉宁手性选择剂）上完成，流动相为含0.02%乙酸的水（A）与含0.02%乙酸的甲醇（B），流速0.25 mL/min，柱温30 °C，进样量3 μL，梯度洗脱40 min。检测采用电喷雾电离（ESI）正离子模式多反应监测（MRM），每分析物监测两个离子对。统计分析使用SAS PROC PRINCOMP与PROC DISCRIM（version 9.4）进行主成分分析（PCA）与判别分析。样本队列为来自西班牙养蜂人协会与当地市场的15份蜂蜜样品（M1–M15），经孢粉学分析确认植物学来源包括向日葵、驴喜豆、油菜、薰衣草、石楠、三叶草与多花蜜，多数样品来自卡斯蒂利亚-莱昂地区。
研究结果
3.1 样品处理优化：通过评估蜂蜜用量（0.5与1.0 g）与水的体积（5–10 mL），确定1.0 g蜂蜜与10 mL水为最优，回收率86%–113%、基质效应低于20%；以水进一步稀释导致峰重现性差，改用甲醇后峰重现性明显改善且不影响回收率与基质效应；与既往研究相比结果相当，且方法在两种不同蜂蜜中均得到评价。
3.2 HPLC-MS/MS条件优化：乙腈（ACN）无法实现完全洗脱并导致压力不稳，甲醇-水（80:20，v/v）被选为有机改性剂；pH 4.8与5.8无可检测峰，pH 3.3信号清晰，故以0.02%乙酸调节；铵盐添加导致信号抑制或无改善，故不加盐；优化梯度在40 min内实现18种氨基酸对映体完全分离；替考拉宁对D-对映体相互作用热力学更强，故L-对映体先于D-对映体洗脱；His因侧链咪唑基团影响质子化状态与取向而未达基线分离；质谱源参数经优化确定为350 °C、3500 V与45 psi。
3.3 方法验证：选择性实验显示内标保留时间处无同量异位干扰，溶剂与基质提取物中质谱图可比；LOD为2–100 μg/kg、LOQ为6–340 μg/kg，低于研究样品典型浓度且与既往研究相当或更优；基质效应在?16%至+13%之间，表明基质未显著影响响应，故可用溶剂标准曲线定量；校准曲线在LOQ至250 μg/L范围内线性良好，R2多数高于0.99，反算浓度偏差低于20%；精密度%RSD均低于10%；回收率86%–113%。
3.4 分析指标评价：BAGI评分为77.5，主要优势为样品制备简单低成本、无需溶剂萃取/SPE/衍生化与预浓缩、试剂常见；主要局限为色谱分析时间约40 min、通量约每小时1.5个样品。
讨论与结论
讨论部分指出，该方法的样品处理与既往蜂蜜AAEs测定研究的最佳值相当，且优势在于对两种不同蜂蜜类型进行了评价；直接对映分离无需衍生化，保留分析物天然化学结构，符合GAC与WAC原则；His未完全对映分离的可能原因被作者明确表述为推测性解释，即其侧链额外可电离咪唑基团可能影响质子化状态、分子取向及与手性选择剂的相互作用模式，但相关具体相互作用未经实验探究。研究结论为：所提出的HPLC-MS/MS方法结合稀释-直接进样与替考拉宁手性固定相，可实现蜂蜜中游离氨基酸对映体的直接、简单、稳健测定，方法具有高精密度、良好灵敏度与满意回收率，AAEs谱可区分植物学与地理来源，为蜂蜜真伪鉴别与溯源提供了有价值且互补于常规非手性谱分析的信息。
