《Molecular & Cellular Proteomics》：Region-resolved multi-layer proteomics reveals proteostasis-centered post-translational remodeling during mouse brain aging
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脑衰老是一个空间异质性且多层级的过程，然而蛋白质丰度与翻译后修饰（PTMs）如何在不同脑区及时间尺度上协调仍不完全清楚。本研究呈现了一个脑区分辨的小鼠脑衰老多层蛋白质组学图谱，整合了涵盖从青年期到衰老期的11个解剖区域及5个时间点的蛋白质组、磷酸化组、乙酰化组
脑衰老是一个空间异质性且多层级的过程，然而蛋白质丰度与翻译后修饰（PTMs）如何在不同脑区及时间尺度上协调仍不完全清楚。本研究呈现了一个脑区分辨的小鼠脑衰老多层蛋白质组学图谱，整合了涵盖从青年期到衰老期的11个解剖区域及5个时间点的蛋白质组、磷酸化组、乙酰化组和泛素化组数据。通过采用PTM优化的dia-PASEF采集策略，研究人员在628次进样中定量了11,460种蛋白质、29,225个磷酸化位点、5,345个乙酰化位点和5,197个泛素化位点，从而能够系统性分析年龄相关的分子轨迹。研究发现，无论是在蛋白质水平还是PTM水平，衰老模式均表现出高度的区域特异性，其中脑桥在衰老相关信号通路的磷酸化水平改变方面尤为显著。值得注意的是，研究人员在衰老海马体中揭示了一个以蛋白质稳态为中心的调控轴，在该轴中，Tau蛋白上的泛素化减少与乙酰化增加共同作用，可能损害其降解。利用端粒酶缺陷小鼠模型（Tert KO），研究表明端粒功能障碍扰乱了衰老相关的分子轨迹，并诱导出一种不同于生理性脑衰老的、分叉的蛋白质稳态与应激反应状态。综上所述，本研究提供了一个脑衰老的时空多层蛋白质组学资源，并揭示了与区域特异性脆弱性和Tau蛋白失调相关的、以蛋白质稳态为中心的翻译后重塑景观。
研究背景与科学问题
哺乳动物大脑展现出高度复杂的结构和功能特征，由特化的解剖区域、多样化的细胞类型及精密协调的分子程序共同维持。在衰老过程中，这种复杂性面临分子损伤累积和细胞稳态下降的持续挑战，最终导致认知、感觉处理和运动协调功能的衰退。在众多衰老分子标志中，蛋白质稳态丧失——即蛋白质合成、折叠、运输和降解精确平衡的破坏——已被确认为脑衰老相关易损性的核心决定因素。与其他组织不同，神经元高度依赖强大的蛋白质稳态网络以防止错误折叠蛋白的积累并维持突触完整性。现有证据表明，蛋白质稳态不仅反映蛋白质丰度的变化，更受到复杂翻译后修饰（PTMs）层的精细调控，其中磷酸化、乙酰化和泛素化作为快速可逆的分子开关，控制着蛋白质稳定性、酶活性和相分离等关键过程。
尽管过去几十年在模式生物中的研究取得了重大进展，并鉴定出能够调节寿命和健康寿命的遗传与环境干预手段，但转录组学研究仅能提供mRNA层面的信息，而蛋白质水平及其PTMs所产生的蛋白质形式的多样性才是最终决定细胞活性的关键。然而，目前大多数研究仅聚焦于单个脑区或单一分子层，无法捕捉脑衰老背后的空间组织与多层调控逻辑。此外，衰老本质上是一个动态过程，对年轻和老年状态的静态比较无法解析驱动分子重塑的时间轨迹。因此，整合空间分辨率、时间动力学和多层测量对于揭示脑衰老的调控逻辑至关重要。
研究内容与主要结论
针对上述空白，研究人员绘制了一个跨越11个解剖区域的衰老小鼠脑时空多层蛋白质组学图谱。通过整合自然衰老与端粒酶缺陷早衰模型，研究人员描绘了端粒磨损如何重塑分子轨迹并破坏调控协调性。关键的是，研究人员在海马体中鉴定出一个以蛋白质稳态为中心的调控轴，其中乙酰化和泛素化之间的竞争性失衡汇聚于Tau蛋白生物学，导致其降解受损。这些发现提供了一个系统水平的景观，解码了维持乃至最终崩溃的脑蛋白质稳态所遵循的分子逻辑。
主要关键技术方法
研究人员采用了基于timsTOF Pro质谱仪的dia-PASEF（平行累积-串行碎裂结合数据非依赖性采集）技术，并针对磷酸化、乙酰化和泛素化三类PTM设计了前体密度引导的可变窗口采集方案（py_diAID工作流）。通过构建项目特异性光谱库（基于77次全局蛋白质组、105次磷酸化组、11次乙酰化组和12次泛素化组的DDA进样），并结合DIA-NN深度学习软件进行数据分析，实现了高深度和高精度的定量。实验设计包括野生型C57BL/6J雄性小鼠（5个年龄组：4-6周、3个月、6个月、12个月和18个月）和Tert基因敲除（Tert-/-）早衰小鼠（3个年龄组：4-6周、3个月和6个月），每组3个生物学重复，共覆盖11个脑区。
研究结果
区域分辨的衰老小鼠脑多层分析：研究人员建立了脑区分辨的多层分析方法，共鉴定出11,460个蛋白质组、29,225个磷酸化位点、5,345个乙酰化位点和5,197个泛素化位点。无监督降维显示，脑区身份是所有组学层分子变异的主要来源，约占总方差的60%，而年龄和基因型贡献次要结构。当在单个脑区内进行降维时，样本按年龄分离，表明衰老伴随着渐进且结构化的蛋白质组重塑。
分叉的蛋白质组轨迹揭示区域特异性的衰老易损性：通过全脑平均后的Mfuzz聚类和线性回归分析，研究人员发现衰老模式具有显著的区域异质性。脑桥拥有最多的年龄相关蛋白质（468个），且以下调为主；海马体则以上调为主（316个）。功能富集将年龄相关蛋白分为四大模块：细胞外基质（ECM）、DNA损伤应答、突触结构和能量代谢。海马体表现出独特的致密核心囊泡胞吐蛋白富集，暗示其承受着巨大的蛋白质稳态负担。
脑桥中Rho GTPase信号的磷酸化重塑：在磷酸化层面，脑桥呈现出独特的分子特征：广泛的蛋白质丰度下降伴随着大量位点的磷酸化矛盾性升高。通路分析显示Rho GTPase信号在脑桥中富集最显著。上游激酶预测鉴定出PRKCG（蛋白激酶C Gamma）为候选上游激酶。基序分析进一步揭示，脑桥在上下调磷酸化位点中均表现出最显著的基序富集，如.TP.、.R..S.和.SP.，这与AGC家族激酶信号一致。
脑衰老过程中乙酰化和泛素化重塑的区域特异性失衡：在海马体和皮层中，研究人员分析了乙酰化和泛素化动态。泛素化分析显示两个脑区的剪接体复合物、RNA加工和核糖核蛋白通路中泛素化水平持续降低。在共享赖氨酸位点，海马体中泛素化主导位点富集于应激反应过程，而皮层中则富集于离子稳态和能量代谢过程。乙酰化主导位点在两个脑区均富集于糖酵解和突触囊泡过程。
脑衰老过程中的皮层选择性表观遗传调控因子：对表观遗传调控因子的聚焦分析显示，皮层中几乎所有显著的调控因子相关乙酰化位点均随年龄下降，包括乙酰转移酶Cbp和Tip60、H3K4甲基转移酶Mll1/Mll2、去乙酰化酶Sirt5、甲基CpG阅读器Mecp2、溴结构域阅读器Brd7和Brd8以及多个H1连接组蛋白。这些变化在皮层中显著而在海马体中不显著，表明表观遗传调控机器的改变是脑衰老的皮层选择性组分。
阶段特异性分子转变与非单调衰老轨迹：通过相邻年龄区间差异分析和Mfuzz聚类，研究人员发现了非线性的衰老轨迹。海马体中，蛋白质组、磷酸化组和乙酰化组的改变主要集中在3-6个月的早期成年过渡窗口，而泛素化组的改变主要在晚期衰老阶段（12-18个月）。
多层整合揭示海马体中协调的蛋白质稳态相关变化：跨层整合分析将海马体的年龄相关变化组织成四个主要调控模块：蛋白质稳态与RNA加工、突触传递与神经元功能、DNA维持以及能量代谢。蛋白质稳态相关通路（如蛋白质折叠）表现出乙酰化水平显著下降，而RNA生物合成和加工通路则同时表现出乙酰化和泛素化降低。
Tert缺陷小鼠中衰老相关分子轨迹的改变：利用Tert KO早衰模型，研究人员发现端粒功能障碍激活了氧化应激相关通路的蛋白水平，但同时损害了其磷酸化调控网络。泛素化景观呈现独特的双相模式：3个月时升高，6个月时显著下降，表明从适应性补偿向调节衰竭的加速转变。
衰老过程中Tau蛋白的海马体特异性翻译后调控：在海马体中，Tau蛋白（Mapt）丰度随年龄增加，而其微管结合区的泛素化减少，同时K312位乙酰化增加及邻近位点磷酸化升高。这种乙酰化与泛素化在共享或邻近位点的反向关系支持一种竞争性修饰模型。研究人员鉴定出Trim28在海马体中的表达显著下降，可能削弱底物特异性泛素化。尽管多种蛋白酶体亚基和溶酶体组分丰度升高，Tau泛素化仍然失调，表明降解系统在功能上未能有效恢复蛋白质稳态。
讨论与结论
本研究生成了一份空间分辨的多组学脑衰老图谱，整合了蛋白质组和三大主要翻译后修饰层，覆盖解剖定义的脑区和多个衰老阶段，并结合端粒酶缺陷早衰模型，允许在单一框架内进行跨层和跨区的衰老机制解析。在方法学上，基于timsTOF仪器的dia-PASEF技术、前体密度引导的可变窗口采集方案以及深度学习DIA数据分析软件的进步，使得从微量组织样本中进行高通量、高精度定量成为可能。
研究分析揭示，脑衰老是一个高度区域特异性的过程，以不同的翻译后调控程序为特征。脑桥表现出以信号传导为主导的衰老特征，即在广泛蛋白质下降的同时伴随密集的磷酸化调控，这可能代表了一种维持后脑回路完整性的局部应激响应模式。海马体则表现出独特的蛋白质稳态脆弱性，其中Tau蛋白上乙酰化与泛素化的竞争性失衡导致其稳定性增加和降解受损。通过整合时间动力学、PTM协调和端粒酶缺陷模型，本研究提供了系统水平的证据，阐明蛋白质稳态相关重塑如何在脑衰老过程中出现，并与海马体等易损区域中的Tau蛋白失调相关联。这些多层改变为生理性衰老与神经退行性疾病相关的分子特征之间提供了机制联系。
