肾功能下降、年龄与性别影响尿糖胺聚糖（GAGs）测定水平并可能导致诊断误判

《Molecular Genetics and Metabolism》：Reduced renal function, age and sex influence the measured level of glycosaminoglycans (GAGs) and could lead to diagnostic misinterpretation

　　

背景：尿糖胺聚糖（U-GAG）是黏多糖贮积症（MPS）的诊断生物标志物。肾功能不全如何影响慢性肾脏病（CKD）患儿尿糖胺聚糖/肌酐（crn）比值，目前研究甚少。本研究探讨肾小球滤过率（GFR）对U-GAG/crn比值的影响，并评估年龄、性别及提示肾脏疾病的尿液试纸标志物（蛋白、血液、葡萄糖和白细胞）的作用。方法：研究纳入96例CKD患儿（年龄范围0.25–17.5岁）。GFR通过七点血样碘海醇清除率测定（范围6.3–153 mL/min/1.73m2）。U-GAG采用二甲基亚甲蓝（DMB）法测定。参考队列为2017至2022年实验室常规检测样本（n = 10,165）。U-GAG/crn比值的年龄校正经适当转换和回归分析完成。通过z分数考察GFR、总尿蛋白-肌酐比值（U-PCR）、年龄、性别及尿液试纸标志物对U-GAG/crn比值的影响。结果：校正U-PCR后，GFR与U-GAG/crn比值呈正相关（p < 0.001），其效应量对诊断判读具有意义。尿血液和葡萄糖与U-GAG/crn比值升高相关，且U-GAG/crn比值在青春期启动时呈现具有统计学显著性的年龄-性别交互作用（p < 0.001）。结论：GFR、U-PCR、年龄和性别是U-GAG/crn比值的显著协变量，当U-GAG/crn比值与临床情况不符时应予以评估。GFR降低可能与MPS筛查假阴性风险增加相关，而U-PCR升高可能与MPS筛查假阳性相关。简介：GFR影响尿糖胺聚糖水平。

研究背景与问题

黏多糖贮积症（MPS）是一组因糖胺聚糖（GAGs）溶酶体降解酶缺陷所致的遗传性代谢病（IMD），GAGs蓄积可导致骨发育不良、器官肿大、矮小、发育迟缓及脑、神经系统和视觉受累等表现。患者出生时通常正常，随GAGs蓄积症状逐渐进展。治疗手段包括造血干细胞移植和酶替代治疗，底物减少与基因治疗等新方案亦显示前景，早期治疗可减轻疾病负担并改善长期预后。二甲基亚甲蓝（DMB）法是MPS最常用的筛查方法之一，简便、经济、可靠，但已知受样本处理不当、肝素治疗以及血红蛋白、蛋白、含硫污染物、含色素结合剂药物和纸尿裤中丙烯酸聚合物等干扰，可致假阳性或假阴性；阳性结果须进一步经电泳、薄层色谱（TLC）或质谱（MS）方法鉴定硫酸类肝素（HS）、硫酸皮肤素（DS）、硫酸软骨素（CS）和硫酸角质素（KS），最终由酶活性测定和基因分析确诊。年龄长期被视为U-GAG/crn比值的协变量，部分研究提示性别亦影响该比值，但在青春期平均启动年龄（女孩约10.4岁、男孩约11.7岁）附近的年龄-性别特异性变异尚未被系统研究。既往Bower等人在成人中基于血清肌酐（S-crn）测定发现GFR下降时血清GAG（S-GAG）蓄积，尿中未能检出HS，CKD患者尿CS较对照升高；但据研究人员所知，实测GFR及肾脏疾病标志物对儿童U-GAG/crn比值的影响此前未见发表。因此本研究旨在探讨肾功能下降的生物标志物对CKD患儿U-GAG/crn比值的影响，并评估肾小球滤过、蛋白尿以及年龄和性别在多大程度上影响U-GAG/crn比值检测结果的判读。

研究设计与结论

研究人员纳入96例处于稳定期（无水肿、未进行透析或移植治疗）的CKD患儿（女41例、男55例），CKD 1、2、3及4–5期分别为28、27、23、18例，来自Oslo University Hospital和Haukeland University Hospital（ClinicalTrial.gov注册号NCT01092260）；参考队列为2017年1月至2022年12月提交常规代谢筛查的连续尿样，排除已知MPS病例及重复样本后共3988例女性（年龄中位数[范围]3.89[0–84.7]岁）和6177例男性（4.11[0–85.3]岁），因挪威U-GAG分析纳入标准代谢筛查组合而不论临床指征，该队列代表未经选择的实验室患者人群而非健康对照组。研究结论为：GFR、U-PCR、年龄和性别是U-GAG/crn比值的显著协变量，当该比值与临床情况不符时应予评估；GFR降低可能与MPS筛查假阴性风险增加相关，U-PCR升高可能与假阳性筛查相关。

关键技术方法

采用七点血样（注射后10至300 min）碘海醇清除率测定GFR作为金标准，碘海醇经高效液相色谱（HPLC）分析、245 nm紫外检测；U-GAG采用改良DMB法测定，样本经稀释归一至2 mM crn，520 nm比色，结果以每mmol crn的GAG毫克数表示，并以正常对照混合尿及ERNDIM低、高水平质控评估日间分析质量；尿肌酐采用酶比色法测定，参考队列行尿液试纸检测，CKD队列总尿蛋白经505 nm与700 nm浊度双色法测定；统计学上以性别分层滚动中位数考察年龄依赖性，采用广义可加模型（GAMLSS）建模并据AIC选择参数，以条件Box-Cox t分布计算z分数，采用多元线性回归及Kendall's τ、Theil-Sen回归分析。

研究结果

3.1 U-GAG/crn比值的年龄与性别依赖性：滚动中位数显示两性曲线初期相似，但在青春期启动时明显分离；两性在生后最初数周均急剧升高，约3周时达峰值约40 mg/mmol，随后陡降并逐渐趋缓，约10岁时降至约6.5 mg/mmol；此后在女性10–11岁、男性12–13岁再次较陡下降，男性曲线延迟下降使其在青春期前几年U-GAG/crn比值高于女性，14–15岁时差异最大约2.3 mg/mmol（或68%），但男性曲线趋缓更慢，约16岁后低于女性曲线；女性曲线约20岁时稳定于约2.6 mg/mmol，男性约25岁达最低点约2.3 mg/mmol，成年期两曲线均缓慢回升。嵌套GAMLSS模型似然比检验显示该年龄-性别交互作用具有统计学显著性（p < 0.001），最终模型在μ中对年龄采用性别分层平滑样条、在σ中采用共同平滑样条，v与τ仅以截距建模，得到右偏（v = ?0.36）、重尾（τ = 1.5）的条件Box-Cox t分布；残差虫图在青春期年龄段显示轻度偏差，总体拟合被认为足以用于校正。

3.2 GFR与尿蛋白对U-GAG/crn比值的影响：据AIC_c选择U-PCR而非尿白蛋白-肌酐比值（U-ACR）作为肾损伤标志物；最终模型以年龄和性别校正后的U-GAG/crn比值为因变量、GFR与对数转换U-PCR（log U-PCR）为自变量，二者均与U-GAG/crn比值显著相关（p < 0.001），R²为0.254；未校正模型中GFR回归斜率为0.010 z分数/(mL/min/1.73m²)（95% CI：?0.001–0.021），校正U-PCR后为0.021 z分数/(mL/min/1.73m²)（95% CI：0.010–0.031），即GFR由90降至60或由60降至30 mL/min/1.73m²，对应U-GAG/crn比值下降约0.62个校正标准差；例如1周龄女性U-GAG/crn为67.3 mg/mmol（高于估计的年龄和性别特异性参考上限60.5 mg/mmol）时，将降至56.3 mg/mmol（低于该上限）。U-GAG/crn比值与log U-PCR的关联更强，对数尺度回归斜率为0.73 z分数，即U-PCR由3升至30或由30升至300 mg/mmol，对应实测U-GAG/crn比值升高1.7个z分数，在1周龄女性中相当于由56.3 mg/mmol升至93.9 mg/mmol（高于估计上限）。散点图显示至少两个z分数远高于4的视觉离群值，但基于Cook距离的影响诊断表明无单一观测对最终回归结果产生不成比例影响。

3.3 与肾脏疾病试纸标志物的关联：排除一个以上标志物非阴性结果的样本后，6764份参考样本纳入分析；除葡萄糖外各标志物水平的箱线图未见明显趋势，但葡萄糖、血液和白细胞均与U-GAG/crn比值z分数呈统计学显著相关（p = 0.003、0.005和0.024）；葡萄糖和血液呈正相关（Kendall's τ分别为0.029和0.028），白细胞呈负相关（Kendall's τ ?0.022）；葡萄糖和血液的回归斜率估计值（每试纸单位0.342和0.171个z分数）达到对诊断判读有意义的效应量（Cohen's d > 0.25），白细胞（每试纸单位?0.045个z分数）则未达到。

讨论与结论

讨论指出，肾脏疾病可通过多种途径影响U-GAG/crn比值，其程度若未被考虑可致MPS筛查假阴性和假阳性；参考队列中年龄和性别的影响远超分析变异。大样本参考队列揭示了青春期启动时两性中位U-GAG/crn比值的显著分离，女性中位数下降更早而男性曲线在青春期后期降至女性之下，两性差距随年龄逐渐缩小；肌酐排泄主要反映肌肉量，排泄的GAGs主要来自结缔组织，这可解释U-GAG/crn比值的性别特异性变化，女性较早下降或反映青春期启动与骨生长较早，男性更大且持续的下降或由肌肉生长更多及睾酮经L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶（AGAT）上调促进肌酐生成所致。较大的新生儿样本使研究人员得以较精细地呈现生后变化，而既往研究因新生儿期样本有限未能显示该陡升。校正U-PCR后GFR与U-GAG/crn比值显著相关且效应量具诊断意义，这与Klujber等人在10例慢性肾衰竭患儿中发现的24 h尿GAG排泄减少一致，而与Bower等人在5例成人慢性肾衰竭中发现的24 h尿GAG排泄增加相反，差异可能源于样本量小及以肾衰竭与健康对照作较粗比较。研究还观察到U-PCR与U-GAG/crn比值显著且具诊断意义的关联；DMB染料存在多种已知干扰，蛋白尿已知可致U-GAG假性降低，研究人员在向尿样加入递增白蛋白的实验中证实了该效应，但CKD队列数据显示相反模式，即较高U-PCR与较高而非较低的U-GAG/crn比值相关，不能以蛋白负干扰解释；由于尿肌酐是U-PCR与U-GAG/crn的共同分母，尿肌酐排泄变异可诱导二者正相关，使用z分数可部分减轻该效应，此外导致尿蛋白排泄增加的疾病过程也可能增加尿GAG排泄。无论机制如何，结果提示在给定GFR下较高U-PCR与较高U-GAG/crn比值相关，在给定U-PCR下较低GFR与U-GAG/crn降低相关，可能分别促成无MPS者的假阳性筛查和MPS患者的假阴性结果，但本研究无法直接评价筛查性能。由于CKD队列样本量有限无法测定更多尿液标志物，研究人员借助参考队列的试纸标志物评估潜在混杂，发现尿血液和葡萄糖与U-GAG/crn比值之间可能存在具诊断意义的关联，但其方向与GFR关联相反，故这些因素较不可能解释所观察到的GFR关联，不过因该分析仅能在参考队列进行，不能完全排除混杂；无论其是否为混杂因素，效应量均足以被认为与诊断判读相关，提示判读U-GAG/crn结果时评估尿血液和葡萄糖可能有意义。局限性包括使用常规DMB法（空白加20 mg/L单点校准），但以四个中间浓度（1.25、2.5、5和10 mg/L）评估显示校准曲线完全线性（R² = 0.9992）；该法易受肝素治疗等已知干扰影响，两个队列均无更多信息识别其他潜在干扰因素；未纳入肾功能下降的MPS患者，无法直接评估筛查性能或肾功能对假阴性筛查结果的影响，但已知部分MPS患者尿GAG浓度可与参考人群上限重叠、仅略高于既定筛查切点，此时包括肾功能下降在内的降低尿GAG浓度的因素可能使结果跨越筛查阈值，而实测GFR在MPS诊断评估中并非常规可得；本研究发现GFR和U-PCR与DMB法测定的U-GAG/crn相关在多大程度上适用于LC-MS等其他分析方法尚待确定，未来需纳入肾功能评估的MPS队列研究。优势在于采用多点碘海醇清除率准确测定GFR的患者数量相对较多，而非以基于肌酐和胱抑素C的方程估算GFR；据研究人员所知，尚无其他关于儿童U-GAG与CKD的可比研究；参考队列样本量充足且新生儿期样本量稳健，且来源于临床相关患者人群而非健康对照，更贴近常规诊断实践中需将MPS患者与因多种其他疾病接受评估者相鉴别的场景。

结论译文：本研究证明，就GFR和U-PCR而言的肾脏疾病以及年龄和性别均为U-GAG/crn比值的统计学显著协变量。随年龄的显著变异要求以大量参考个体构建高粒度参考区间。使用大参考队列还可对较小数据集中的关联进行稳健评估，这在代谢病领域较为常见。肾脏疾病中代表肾损伤与肾功能不全不同方面的GFR和U-PCR，可能影响MPS筛查结果的判读。这凸显了解读检测结果时结合临床背景的重要性，尤其当U-GAG/crn比值与临床情况不符时。