《Molecular Immunology》：Blood?derived factor?mediated cytotoxicity and impaired in vivo persistence of NK?92 cells
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•大多数癌症患者的血清对NK-92细胞具有强烈的细胞毒性。•在健康捐赠者中，只有IgM能够与NK-92细胞结合；而在部分癌症患者中，IgM和IgG的结合能力均较低。•补体激活是驱动NK-92细胞凋亡的主要机制；血液中的蛋白酶则只起到次要作用，其具体机制尚不明确。•NK-92细胞表
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大多数癌症患者的血清对NK-92细胞具有强烈的细胞毒性。
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在健康捐赠者中，只有IgM能够与NK-92细胞结合；而在部分癌症患者中，IgM和IgG的结合能力均较低。
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补体激活是驱动NK-92细胞凋亡的主要机制；血液中的蛋白酶则只起到次要作用，其具体机制尚不明确。
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NK-92细胞表面缺乏补体调节蛋白CD35、CD55和CD59。
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NK-92细胞上的糖基化模式发生改变，可能成为天然IgM的识别靶点。
引言
NK-92细胞系以发现年份（1992年）命名，由加拿大温哥华的一位50岁男性患者的单核外周血细胞建立，该患者被诊断出患有侵袭性NK细胞淋巴瘤（Klingemann, 2023a）。在体外实验中，NK-92细胞对血液系统恶性肿瘤和多种实体瘤细胞系均表现出极强的细胞毒性，显示出广泛的抗肿瘤潜力。2001年，NK-92首次被用于癌症治疗的临床研究，目前它是唯一获得FDA批准用于临床使用的NK细胞系（Hans et al., 2016）。然而，根据临床研究结果，NK-92及其工程改造衍生物的效果普遍有限，并存在显著的个体差异。
NK-92来源于淋巴瘤患者的未分化NK细胞前体，具有致癌潜能。因此，在临床使用前，通常会用1000 cGy（铯源）对其进行辐照处理，这种剂量既能保持NK-92的细胞毒性，又能消除其增殖能力（Hans et al., 2016, Klingemann, 2023a）。此外，NK-92细胞的体外增殖严重依赖于外源性提供的IL-2（200 IU/mL），最低浓度约为10 IU/mL（4587 pg/mL）才能维持其增殖。健康个体的血液中IL-2水平通常低于5–10 pg/mL，即使在急性感染情况下也仅能达到几十到几百pg/mL。因此，理论上肿瘤患者体内的IL-2浓度不足以支持NK-92细胞的持续增殖。此外，NK-92细胞在激活后不会像T细胞那样大量增殖，而是逐渐死亡。这些因素共同导致NK-92细胞在患者体内的持久性较差。因此，研究界对其持久性持保守态度，目前也缺乏系统的国际性研究。
我们的团队连续进行了两项基于NK-92细胞的嵌合抗原受体修饰NK-92细胞（CAR-NK92）治疗实体瘤的临床研究（NCT03656705已完成；NCT05528341正在进行中）。在这些研究中，我们观察到CAR-NK92细胞在注入患者体内后清除速度异常加快，这一现象与辐照或体内IL-2缺乏无关。研究发现，在体外实验中，NK-92细胞与健康捐赠者和肿瘤患者的血清共培养时会导致NK-92细胞显著凋亡。多种血液来源的因素可引发细胞凋亡，主要是通过补体介导的细胞毒性作用，包括膜攻击复合体（MAC）的形成和过敏毒素的生成。例如，C5的蛋白水解会释放生物活性过敏毒素C5a，已知C5a能诱导多种细胞系的凋亡（Flierl et al., 2008, Mahajan et al., 2016, Mrozewski et al., 2024, Tsai et al., 2019, Ward, 2010, Wezel et al., 2014）。此外，血液中的蛋白酶系统也会影响细胞存活状态，这些蛋白酶可以切割对NK-92细胞增殖和存活至关重要的细胞因子和表面受体（Rybakin et al., 2019；Sun et al., 2024），从而损害NK-92细胞的功能完整性和生存能力。血液来源因子的细胞毒性作用会导致NK-92细胞在体内注入后迅速“失活”，这一现象在以往的研究中被忽视。为了解剖其背后的机制，我们采取了多种实验干预措施，包括针对经典补体途径、凝集素途径和替代补体途径的抑制剂、热灭活血清、来自无内源性抗体的严重免疫缺陷NCG小鼠的血清、过敏毒素抑制剂以及蛋白酶抑制剂。研究结果表明，补体激活是NK-92细胞凋亡的主要驱动因素，而血液中的蛋白酶仅对其存活产生轻微的不良影响。明确NK-92细胞在血液中触发补体和蛋白酶激活的机制对于推进其临床应用至关重要。
章节摘录
志愿者招募
本研究招募了8名肿瘤患者。这8名患者的基本信息见补充表1。同时，我们团队还随机挑选了10名健康志愿者参与实验。
知情同意
在河南医科大学第一附属医院伦理委员会（IRB）的批准下（批准编号[2022] Lun Xi Bao Shen Zi (6)），我们启动了一项I期临床试验（NCT05528341），旨在评估NKG2D-CAR-NK92细胞疗法的安全性和有效性。
血清中的细胞毒性是导致NK-92细胞在体内快速清除的关键因素
在我们团队针对嵌合抗原受体修饰NK-92细胞（CAR-NK92）治疗实体瘤的两项连续临床研究（NCT03656705, NCT05528341）中，我们未能观察到预期的治疗效果。治疗过程中发现，即使给予高达10?个CAR-NK92细胞的剂量，24小时后患者外周血液中也检测不到CAR-NK92细胞（见补充图1）。
我们进一步分析了...
讨论
有研究表明，将辐照后的NK-92细胞注入患者体内后，外周血中的NK-92细胞计数在24–48小时内会降至无法检测的水平（Tonn et al., 2013）；然而，在本研究中，患者在接受细胞注射前接受了甲基泼尼松龙预处理。已知该药物能显著抑制补体活性，例如导致补体组分4（C4）水平显著下降（Dernek et al., 1999）。另外，氟达拉滨也被用于...
结论
总之，本研究表明某些癌症患者的血清中的内源性IgM（偶尔也有IgG）能够与NK-92细胞结合。我们进一步研究了介导NK-92细胞毒性的血液因素，发现补体介导的细胞毒性是健康个体中NK-92细胞凋亡的主要驱动因素，而基质金属蛋白酶（MMPs）仅起辅助作用。C5a过敏毒素似乎并不参与这一过程。
CRediT作者贡献声明
牛志远：写作、审稿与编辑、验证、方法学设计、资金筹集、概念构思。王梦军：数据可视化、实验设计、数据管理。赵静文：数据可视化、实验设计、数据管理。严阳春：数据可视化、实验设计、数据管理。薛凯远：数据可视化、实验设计、数据管理。徐炳倩：数据可视化、实验设计、数据管理。金新茹：数据可视化、实验设计、数据管理。郭长江：数据可视化
资助
本研究得到了河南省自然科学基金（项目编号：252300421428）、新乡科技计划（重点项目）（项目编号：GG202605）、河南省科技研发联合基金（工业项目）（项目编号：235101610047）以及河南省科技发展计划（项目编号：252102311162）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
牛志远|王梦军|赵静文|严阳春|薛凯远|徐炳倩|金新茹|郭长江|支良通|李明峰|朱吴陵
