《Molecular Immunology》：Extracellular vesicles from 4T1 breast cancer cells changed cytokine production from mice peripheral blood immune cells
编辑推荐：
摘要细胞外囊泡（EVs）在肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用中起着重要作用，并且还能调节乳腺癌的进展。因此，研究肿瘤细胞与免疫细胞之间的通讯对于理解肿瘤免疫学及新兴的免疫治疗方法至关重要。本文旨在探讨4T1乳腺癌细胞释放的EVs对小鼠外周血单核细胞（PBMCs）的体外影响。实验测量
摘要
细胞外囊泡（EVs）在肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用中起着重要作用，并且还能调节乳腺癌的进展。因此，研究肿瘤细胞与免疫细胞之间的通讯对于理解肿瘤免疫学及新兴的免疫治疗方法至关重要。本文旨在探讨4T1乳腺癌细胞释放的EVs对小鼠外周血单核细胞（PBMCs）的体外影响。实验测量了这些EVs对PBMCs细胞活力以及IL-10、TNF-α和IFN-γ表达的影响。PBMCs来自雌性小鼠，而从4T1乳腺癌细胞中分离出了EVs。使用FE-SEM、DLS和流式细胞术等技术对EVs进行了表征，并通过实时PCR和ELISA测定了PBMCs中IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果表明，4T1细胞释放的EVs能够显著降低PBMCs的活力，这种效应具有剂量和时间依赖性（P < 0.05）。经过EVs处理的PBMCs中IL-10、TNF-α和IFN-α的mRNA水平显著上调（P < 0.05），而ELISA检测显示这些蛋白质的水平也显著增加（P < 0.05）。这项研究表明，4T1乳腺癌细胞释放的EVs对PBMCs具有免疫调节作用，表现为细胞活力下降以及IL-10、TNF-α和IFN-γ表达的变化。
引言
癌症是全球第二大死亡原因，仅次于心血管疾病（Nagai和Kim，2017年；Wang等人，2020年）。乳腺癌（BC）作为女性中最恶性的肿瘤，其发病率逐年上升，全球每年新增病例超过一百万例（Fu等人，2022年）。乳腺癌起源于乳腺组织，当癌细胞发生突变并失控生长时，会转移到肝脏、大脑、肺部和骨骼等远端器官，形成新的肿瘤。乳腺癌通过复杂的信号网络与周围细胞和免疫系统进行交流。在多种机制中，细胞外囊泡（EVs），尤其是外泌体（exosomes），已被认为是细胞间信号传导的重要媒介（Welsh等人，2024年）。EVs是小型脂质双层包裹的囊泡，几乎所有细胞（包括癌细胞）都会分泌它们。它们含有多种信号分子，能够在局部或远端微环境中调节受体细胞的功能（Welsh等人，2024年）。EVs的研究具有广泛的应用前景。肿瘤细胞释放的EVs可以在血液和其他体液中检测到，这使它们成为生物标志物研究的工具（De Giorgis等人，2024年）。此外，EVs还被改造为天然的药物递送系统，用于针对癌症的精准治疗（Maghami等人，2025年）。众所周知，肿瘤细胞释放的EVs会促进肿瘤生长、转移、血管生成和免疫逃逸（Liu等人，2026年）。EVs在体内循环并与不同细胞相互作用（Whiteside，2025年）。像4T1细胞这样的乳腺癌细胞释放的EVs携带多种致癌分子，包括参与免疫调节的miRNAs、蛋白质和mRNAs，使它们成为肿瘤-免疫相互作用中的重要媒介（Li等人，2025a）。血液中的EVs可以与外周血单核细胞（PBMCs）相互作用，后者是免疫系统中的一个异质性群体（Rutigliano等人，2025年）。
PBMCs在抗肿瘤免疫中起着关键作用，它们通过调节细胞和体液免疫反应、释放细胞因子和EVs以及介导对癌细胞的细胞毒性来发挥作用（Song等人，2025年；Kleiveland，2015年）。因此，肿瘤细胞释放的EVs对PBMCs的功能调控可能对肿瘤发展和宿主免疫反应产生重要影响。关于肿瘤EVs的确切作用，学术界存在争议；它们既具有免疫刺激作用，也具有免疫抑制作用，这种作用取决于它们的所含物质和目标细胞（Rutigliano等人，2025年；Reale等人，2022年）。例如，EVs中的miRNAs可能抑制免疫调节因子的表达，抑制T细胞增殖，并促进单核细胞分化为髓系来源的抑制性细胞，从而帮助肿瘤逃逸（Coleborn等人，2025年）。相反，EVs也可能激活免疫细胞并诱导抗原呈递，从而促进针对肿瘤的免疫反应（Li等人，2021a）。在乳腺癌领域，EVs的免疫调节潜力是一个重要的研究方向。已有研究证明，乳腺癌细胞释放的EVs可以通过极化巨噬细胞和调节肿瘤微环境中的免疫反应来发挥作用（Mohammad等人，2025年）。然而，也有证据表明，乳腺癌细胞释放的EVs可以激活免疫细胞，这为将其用作癌症疫苗提供了可能（Maralbashi等人，2025年）。使用PBMCs模型具有显著的优势，因为这些细胞代表了生理上相关且异质的免疫群体，能够反映疾病期间的全身免疫反应（Da Rosa等人，2023年）。研究PBMCs的反应可以提供对免疫调节的系统性了解，因为它们在全身循环，能够反映次级外周组织或淋巴器官中的变化（Morillon等人，2020年）。
随着人们逐渐认识到EVs在肿瘤-免疫相互作用中的关键作用，越来越多的研究集中在理解肿瘤细胞释放的EVs如何影响免疫细胞活性上。然而，4T1乳腺癌细胞释放的EVs对小鼠PBMCs中细胞因子反应的具体影响尚未完全阐明。研究这种相互作用至关重要，因为肿瘤来源的EVs可以改变免疫细胞的状态，进而形成免疫抑制或炎症性的肿瘤微环境。因此，明确EV介导的肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用可以为肿瘤免疫学提供新的见解，并有助于开发创新的免疫治疗方法。在这项研究中，我们探讨了4T1乳腺癌细胞释放的EVs对PBMCs活力的影响，以及免疫调节因子IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平。通过同时评估细胞活力和多种细胞因子反应，本研究提供了4T1乳腺癌细胞释放的EVs免疫调节作用的初步证据，为未来关于肿瘤EVs-免疫细胞相互作用的机制研究奠定了基础。
章节片段
PBMCs的分离
使用含有3.8%柠檬酸钠的注射器从雌性小鼠体内采集血液样本。动物通过注射xylazine（10 mg/kg）和ketamine（100 mg/kg）进行麻醉后安乐死。然后，将血液以1:2的比例与PBS稀释，并使用密度梯度离心（1000 × g，持续20分钟）在装有3 ml Atlanta Biologicals分离液的12 ml Leucosep Tubes?中分离。随后转移上清液，冲洗后用RBC裂解缓冲液处理。
EVs的表征
FE-SEM成像显示，部分EVs具有纳米级大小和圆形形态，证明超速离心法能有效分离出这些EVs（图1-i）。此外，DLS分析显示这部分EVs的尺寸分布在90.9 ± 4.2 nm范围内（图1-ii）。流式细胞术分析表明，这些EVs对CD63（77.8 ± 14.4%）和CD81（93.3 ± 10.3%）呈阳性（图1-iii）。
细胞活力
为了研究4T1细胞释放的EVs对PBMCs的影响，我们进行了相关实验。
讨论
肿瘤细胞与免疫系统的相互作用是肿瘤发展的标志。肿瘤细胞释放的EVs有助于调节免疫反应。这些EVs存在于血液中，可能诱发免疫反应。本研究旨在体外探讨4T1细胞释放的EVs对PBMCs的影响，重点关注某些细胞因子的表达。
成功从4T1细胞中分离出了一部分EVs，并对其大小、CD81和CD63标记物以及形态进行了表征。
结论
总之，本研究表明，从4T1乳腺癌细胞中分离出的EVs能有效被小鼠PBMCs内化，并在体外调节其功能。EVs暴露导致PBMCs的活力以剂量和时间依赖的方式下降，在80 μg剂量下48小时后效果最为显著。在相对IC50剂量下，EVs显著上调了IL-10和TNF-α的mRNA和蛋白质水平，而IFN-γ的mRNA水平上升，但其细胞内蛋白质水平没有相应变化。
CRediT作者贡献声明
Yusuf D??ü?：概念提出、研究设计、数据整理、初稿撰写。Amin Daemi：概念提出、方法论设计、监督、审稿与编辑。Ruhiyya Guliyeva Tahira?a：方法论设计、研究实施。Seyyedeh Touran Hosseini：数据分析、验证、研究实施。Gülüzar ?zbolat：软件应用、数据分析、验证。Umut Baran Atan：数据整理、可视化。Zafer Y?nden：审稿与编辑、初稿撰写、验证。
伦理 Approval
所有动物实验方案均获得了伊朗乌尔米亚Rasta研究所伦理委员会的批准（批准号RSRI-RR-404/126）。
不适用。
Yusuf D??ü?|Amin Daemi|Ruhiyya Guliyeva Tahira?a|Seyyedeh Touran Hosseini|Gülüzar ?zbolat|Umut Baran Atan|Zafer Y?nden
