《Molecular Ecology》：Genomic Divergence and Variation in Developmental Plasticity Across Inselberg Populations of a Tropical Frog
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理解表型可塑性（phenotypic plasticity）与局部特化（local specialization）如何被基因流（gene flow）和环境异质性（environmental heterogeneity）所塑造，需要自然界中存在同时在空间隔离程度
理解表型可塑性（phenotypic plasticity）与局部特化（local specialization）如何被基因流（gene flow）和环境异质性（environmental heterogeneity）所塑造，需要自然界中存在同时在空间隔离程度和环境条件上具有变异的系统，但此类系统并不常见。天然不连续的岛屿状生境（inselbergs）可能提供了这一机会。本研究利用岛屿状生境专性蛙类Leptodactylus lithonaetes的种群，评估了生境不连续性是否转化为受限的基因流和遗传结构，进而检验连通性和环境异质性的变异如何塑造表型可塑性与局部特化之间的平衡。研究人员预测，具有较高环境异质性和较高基因流的种群将在生长和发育中进化出可塑性，而处于较同质环境且遗传上更为隔离的种群将表现出降低的可塑性并增加特化。利用>11,000个SNP位点，研究人员表明，跨越300 km的九个岛屿状生境之间表观上的生境不连续性反映为强烈的种群结构和岛屿状生境间不同程度的基因流，呈距离隔离（isolation-by-distance）模式。随后，研究人员检验了蝌蚪是否会因池塘干涸风险（pond-drying risk）而改变其变态时的体型或时间，以及这些可塑性响应是否在具有环境异质性（季节性）的种群间存在变异。尽管蝌蚪在池塘干涸风险下并未可塑性地加速变态，但在干燥胁迫下体重减少的幅度在种群间存在差异，表明体重存在发育可塑性（developmental plasticity）。暴露于较大环境异质性的北部地点表现出较高的存活率和较少的体重损失，从而对环境胁迫具有较高的耐受性。即使在缺乏发育加速的情况下，种群层面对环境胁迫响应的变异也与暴露于较不同质环境的隔离种群中可塑性降低或特化增加相一致。
**研究背景与问题**
自然环境中普遍存在空间和时间上的异质性，这种异质性可能驱动种群间性状进化。种群间的表型差异可能源于通过局部适应（local adaptation）产生的分化特化，也可能源于表型可塑性——即单一基因型对不同环境条件产生不同表型的能力。这两种过程并非相互排斥，因为表型可塑性本身可以在异质环境中局部进化，导致种群不仅在性状均值上存在差异，而且在可塑性程度上也存在差异。尽管在可靠线索和环境异质性存在时适应性可塑性容易进化，但它伴随着生理和调控成本，在更稳定的环境中往往趋于降低。种群间的分化表型可能反映遗传分化与进化可塑性之间的平衡，这取决于种群内可获得的遗传变异、与其他暴露于不同环境机制的种群之间的基因流或隔离程度，以及每个种群所经历的环境异质性程度。空间结构化的环境若具有稳定的局部条件，往往有利于遗传分化并降低性状可塑性——前提是基因流较低。随着基因流增加，其对遗传多样性产生日益均质化的效应，即使在经历不同环境条件的种群之间也是如此，可能因非适应性基因渗入（introgression）而带来迁移负荷风险。然而，如果环境线索可靠且存在足够的遗传变异，适应性可塑性很可能进化，因为高迁移率本质上在整个复合种群（metapopulation）层面将粗粒度环境转变为有效细粒度环境。如果环境条件高度异质且基因流不足以阻止种群间遗传分化，可塑性可能持续存在；然而，可塑性的程度往往根据所经历的异质性水平在种群间分化。表型可塑性、基因流和环境异质性之间的相互作用是理解种群如何在景观中分化和适应的核心。尽管经过数十年的研究，表型可塑性和局部适应在决定表型地理变异中的相对重要性仍然是一个未解决的问题。具体而言，基因流和环境异质性如何共同决定表型可塑性的地理变异以及可塑性与局部特化之间的平衡，仍然构成知识空白。解决这一核心问题的一个主要挑战在于，自然系统很少提供在景观中隔离程度和环境条件上存在变异的离散生境斑块。岛屿状生境——嵌入对比性生境中的孤立岩石露头——正是这样一个系统。研究人员利用Leptodactylus lithonaetes（一种岛屿状生境专性蛙类）作为研究模型，检验种群间基因流和环境异质性的差异是否决定了在应对池塘干涸风险时何时有利于可塑性或局部适应。在哥伦比亚奥里诺基亚地区，岛屿状生境跨越数百公里，在大小和邻近程度上存在变异，产生了一个期望转化为基因流变异的自然连通性梯度。岛屿状生境可能充当陆地岛屿，在空间和生态上均被隔离，隔离预期限制扩散和基因流，促进遗传分化。岩石池塘微生境和景观尺度气候条件可能显著变异，产生温度和降水的地理梯度。Leptodactylus lithonaetes分布于哥伦比亚东部和委内瑞拉西部的奥里诺基亚地区。其蝌蚪仅在依赖降水的岩石池塘中发育，这些池塘以极端且高度变异的条件为特征，包括波动的水文周期。Leptodactylus lithonaetes蝌蚪经常面临池塘干涸风险，可能在水位下降时加速发育速率，即使这样做会导致变态时体型较小和运动性能降低。对L. lithonaetes种群间生长和发育可塑性的比较分析，结合对其种群遗传结构和环境机制地理差异的分析，使研究人员能够检验局部适应和表型可塑性在解释表型分化中的相对重要性。研究人员预测，暴露于较少变异环境的更隔离种群将倾向于表现出较低水平的可塑性并变得局部适应或特化。为检验这一总体思路，研究人员独立量化了基因流、环境异质性以及生活史性状及其对池塘干涸风险响应的可塑性的种群变异。具体而言，研究人员检验了以下假设：（H1）岛屿状生境地理隔离的增加导致种群间遗传分化。研究人员预测生境不连续性可能限制岛屿状生境间的扩散，从而降低基因流并导致距离隔离模式。为检验这一假设，研究人员分析了使用ddRAD-seq鉴定的SNP。（H2）L. lithonaetes幼体在面临池塘干涸风险时将加速发育。研究人员预测暴露于降低水位的个体将以变态时体型较小和运动性能降低为代价加速其发育速率。研究人员使用同质园实验（common garden experiments）通过实验性降低水位来估计种群特异性反应规范（reaction norms），并量化幼虫期、变态时大小和运动性能的可塑性。（H3）可塑性的种群分化将取决于所经历的环境异质性程度以及与其他暴露于不同环境的种群的潜在遗传结构和连通性。研究人员预期环境异质性有利于可塑性的进化，但基因流也将影响种群分化程度。具体而言，研究人员预测经历高环境异质性和高连通性的种群将表现出更强且更相似的可塑性响应，而既环境稳定又遗传隔离的种群将表现出降低的可塑性和更大的性状表达分化。研究人员使用公共生物气候数据库和自己的野外温度记录量化了环境异质性，将这些参数和基因流估计联系起来解释可塑性的种群分化。
**关键技术方法**
研究人员从哥伦比亚九个岛屿状生境采集L. lithonaetes蝌蚪（每个岛屿状生境23–45只，每个池塘仅取3只以减少同窝个体过度代表），使用DNeasy Blood and Tissue Kit提取DNA。采用ddRADseq方法构建四个基因组文库（MseI和EcoRI双酶切，Illumina NovaSeq X Plus PE150测序）。使用ipyrad v.0.9.102进行数据处理，结合radiator、plink2和vcfr进行迭代过滤，获得11,254个非连锁SNP用于种群结构分析。同质园实验于2024年7月从五个地点（Puerto Carre?o、Bojonawi、Mataven、Inírida和Ca?o Vitina）各采集三个泡沫巢，最终四个地点（Inírida卵未成功孵化）各获得30只蝌蚪（3巢×10只/巢），进行4×2因子实验（四地点×两水位处理：恒定高水位HW和干涸处理DD），每处理组合30个重复（总n=240）。环境表征使用Worldclim v.2.1生物气候变量和池塘温度数据记录仪（HOBO Pendant MX Temp，每30分钟记录一次，持续52–58天）。
**研究结果**
**基因组分析**：ddRADseq数据处理获得九个地点281个个体的全基因组数据，过滤后268个样本用于后续分析。种群遗传结构分析显示，非连锁SNP数据集（11,254个SNP）呈现显著的遗传结构。PCA显示Mavicure遗传分化最大，其余地点按地理分布聚类。Admixture分析揭示层次性遗传结构模式，交叉验证曲线在K=5处显示主肘部，对应最强最高层级的数据划分。在较低K值（K=2–8）时，Mavicure与其余地点明显不同。随着K值增加逐步解析更细尺度 subdivision，在K=9时每个采样地点形成独立的遗传聚类。FineRADstructure显示类似结果，Mavicure和Mataven分化最大。所有成对比较中FST值均存在显著差异。Puerto Carre?o、Bojonawi和Santa Helena的FST值相对较低（0.14–0.15），表明中等遗传分化。Tuparro-Anaconda和Tuparro-Maipures种群FST值也相对较低（0.10）。Mataven、Ca?o Vitina和Mavicure与其他地点相比FST值最高（>0.6），表明高度遗传分化。Mavicure地点FST值最高（与Ca?o Vitina达0.94，与Mataven达0.93）。Puerto Carre?o、Bojonawi、Santa Helena、Tuparro-Anaconda、Tuparro-Maipures和Inírida表现出相对较高的杂合度值（0.071–0.081）。相反，Mataven和Ca?o Vitina杂合度值较低（分别为0.024和0.016），而Mavicure记录到最低杂合度值（0.007）。检测到距离隔离模式（Mantel检验：r=0.42，p=0.001）。不对称基因流分析显示，研究地点形成互连网络，但Ca?o Vitina和Mataven未表现出向其他地区的净移民流，Mavicure完全断开。Inírida充当汇地点，从各地接收移民但不贡献移出者。人口统计学推断显示，研究地点经历了对比性的人口历史。部分地点从至少末次冰期至今表现出渐进性（Bojonawi、Santa Helena和Tuparro-Anaconda）或突然性（Puerto Carre?o和Tuparro-Maipures）有效种群大小（Ne）下降。Inírida从全新世开始至今表现出渐进性Ne下降。其他地点似乎在末次冰期（Ca?o Vitina和Mavicure）或早更新世（Mataven）经历了不同幅度的瓶颈。
**同质园实验**：幼虫存活率在整个实验中较低。Mataven个体无一存活至变态。其余地点间达到变态的个体比例存在差异（χ2=31.74，df=3，p<0.001）。Ca?o Vitina变态期存活率比Puerto Carre?o低47.5%（z=?3.29，p=0.006），比Bojonawi低37%（z=?2.72，p=0.020）。变态期存活率不受水位（χ2=1.21，df=1，p=0.272）或其与地点交互作用（χ2=5.20，p=0.158）的影响。幼虫期和变态时大小方面，研究人员观察到蝌蚪中期体重和体深呈南北模式趋势，以及响应池塘干涸风险的短暂约10%体重增加。地点对变态时性状的效应有限，主要影响体重，体重在地点间存在差异（F=5.62，df=2，p=0.042）。最北部地点个体比最南部地点个体更重。Puerto Carre?o变态个体比Ca?o Vitina重18.45%。地点间未检测到变态时间（χ2=2.20，df=2，p=0.333）、RC1"体型"（F=2.42，df=2，p=0.165）、RC2"腿部肌肉"（F=1.37，df=2，p=0.322）或RC3"吻长"（F=0.03，df=2，p=0.974）的差异。水位影响若干性状。干涸处理变态个体比高水位处理轻8.59%（F=11.75，df=1，p=0.001），体型小5.55%（F=28.15，df=1，p<0.001），变态时间晚7天（χ2=29.98，df=1，p<0.001）。未发现RC2"腿部肌肉"（F=0.04，df=1，p=0.851）或RC3"吻长"（F=0.05，df=1，p=0.945）的效应。水位与地点交互作用对变态时体重（F=2.82，df=2，p=0.072）和变态时间（χ2=5.19，df=2，p=0.075）均边缘不显著。响应存在地理变异：干涸条件下体重减少在南部种群（Ca?o Vitina）更大，而北部种群在此条件下变态时间更长。初始发育阶段对变态时间有边缘效应（χ2=3.00，df=1，p=0.083），发育更先进的蝌蚪倾向于需要更长时间达到变态。变态个体运动性能不受地点、水位或初始发育阶段影响。发育可塑性方面，变态时可塑性响应表现为体重减少、体型减小和变态延迟。这些响应显示区域模式，北部地点体重损失最少、体型最大，而变态时间更长。环境变异方面，观察到纬度模式：年平均温度（27°C–28.4°C）、最湿季度平均温度（26.2°C–27°C）、最热月最高温度（33.9°C–36.3°C）、温度季节性（605°C–1022°C）和年温度范围（12.2°C–13.6°C）在北部显示较高值并向南逐渐降低。相反，等温性较高值（73%–81%）在南部发现，向北降低。降水方面，年平均降水量（2072–3073 mm）、最湿季度降水（1127–1296 mm）和最干季度降水（62–283 mm）在北部较低向南增加。降水季节性（50%–81%）在北部最高。池塘表征方面，未发现地点间池塘RC1"最高温度和热变异"（F=2.17；df=5；p=0.087；R2=0.28）、池塘周长（χ2=5.09，df=3，p=0.133）或水深（χ2=2.50，df=3，p=0.328）的差异。然而，地点间池塘RC2"低-平均温度"存在差异（F=7.05，df=5；p<0.001；R2=0.56）。北部地点（Puerto Carre?o和Bojonawi）彼此相似，表现出较高的平均和最低温度。相反，南部地点（Inírida、Ca?o Vitina和Mavicure）值较低，形成独立组。Tuparro-Anaconda具有介于北部和南部地点之间的中间值。
**讨论与结论**
研究人员发现在L. lithonaetes种群间存在显著遗传分化，北部种群比南部种群表现出更高的遗传多样性、更大的基因流和增加的杂合度，南部种群表现出与突然人口下降相一致的特征。研究人员还观察到环境梯度，北部地点更具季节性，池塘最低和平均温度高于南部地点。同质园实验中蝌蚪变态存活率低。与预期相反，暴露于降低水位的个体延迟变态并以更小更轻的体型出现，尤其在南部种群中。然而，结果应在变态时样本量减少的背景下考虑。遗传结构与连通性方面，研究人员发现采样地点间存在显著遗传结构，表明岛屿状生境对L. lithonaetes代表高度不连续的陆地岛屿系列。几个南部地点观察到的显著遗传分化（FST高达0.939）和低杂合度（0.007–0.016）反映了长期隔离和可能的人口瓶颈，正如末次冰期以来遗传多样性突然下降所证明的。南部范围表观较低连通性的机制仍不清楚，可能与岛屿状生境的空间配置差异、其中的景观特征或本研究未明确量化的其他扩散障碍有关。相反，北部地点表现出相对较高的遗传多样性和较低的分化程度（杂合度：0.073–0.081；FST：0.103–0.301），尽管基因流通常较低且在北部成对地点间分布不均。事实上，L. lithonaetes种群的遗传多样性处于两栖动物通常报道的多样性下限。总体而言，强烈的种群分化、距离隔离和不对称基因流支持第一个假设，即生境不连续性限制基因流并塑造岛屿状生境中L. lithonaetes种群的遗传多样性。池塘干涸风险的可塑性响应方面，当面临池塘干涸风险时，L. lithonaetes蝌蚪短暂增加体重和体深。这一响应在大多数地点一致，但Mataven除外，其蝌蚪表现出生长下降和最高死亡率，无个体达到变态。尽管幼虫生长和形态发生这些变化，蝌蚪并未加速发育。相反，所有种群个体延迟变态并以更小体型出现。这种发育加速能力的缺乏在所有种群中一致。然而，即使未能加速发育，所有种群蝌蚪在面临池塘干涸风险时仍经历体重的可塑性减少。因此，研究人员部分拒绝初始假设即L. lithonaetes蝌蚪在池塘干涸风险下会加速发育，但确认它们通过在这种情况下以更小体型变态而经历可塑性。变态时体型减小和发育延迟均预期降低存活率。研究人员评估了变态后运动性能，预期发现运动性能成本，但未检测到水位处理间的差异。环境异质性与可塑性方面，研究人员发现地点间在应对池塘干涸风险能力上存在差异，尽管鉴于实验期间高死亡率该模式应谨慎解释。研究人员观察到南部地点变态时体重减少大于北部地点。北部地点蝌蚪比南部地点蝌蚪需要更长时间达到变态，在面临池塘干涸时体重损失更少。在北部种群中，这种发育延迟可能作为补偿机制，允许更多时间生长并导致变态时更大体重。这些地点间差异与区域气候变异一致。北部地点以更异质的气候条件为特征，包括较低等温性和较大温度及降水季节性。北部地点较高温度和环境异质性可能使种群随时间暴露于更广泛的条件范围，可能有利于缓冲池塘干涸风险负面后果的机制的进化。相反，来自更环境同质区域的南部地点可能经历更稳定条件，这可能降低维持此类响应的选择优势并导致干燥条件下更显著的负面效应。这一解释与先前两栖动物研究一致，表明表型可塑性随环境异质性增加而增加。值得注意的是，地点间对池塘干涸风险背景差异与沿相同梯度的地点遗传结构一致。南部地点经历了更大的隔离和遗传多样性的突然下降，这可能限制其应对环境胁迫的能力并限制发育可塑性。这些效应预期在基因流受限的小隔离种群中更强，其中遗传侵蚀减少了可用于适应的变异，包括可塑性的进化。此外，人口历史可能进一步影响表现，因为遗传多样性的快速下降加剧近交和有害突变的积累。尽管同质园实验样本量有限，观察到的可塑性程度、局部杂合度和人口历史的地理变异模式与关于遗传变异性的理论预测一致。结果表明，L. lithonaetes中降低的适应性发育可塑性不仅与环境异质性有关，还与降低的遗传多样性和增加的隔离有关，正如最初假设的那样。结论：研究结果表明，岛屿状生境可以充当促进遗传分化和发育响应地理变异的岛屿样系统。所有种群幼虫在池塘干涸风险下未能加速发育，但种群间在池塘干涸胁迫下体重减少幅度存在差异。发育可塑性缓冲了风险诱导胁迫的有害效应，并显示出清晰的地理变异，与环境异质性、种群连通性和遗传多样性正相关。相反，遗传隔离结合同质环境倾向于降低可塑性，有利于局部特化。
