《Molecular Ecology》：Biogeographic Barriers and Gut Microbiome Turnover Across the Peromyscus maniculatus Species Complex
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生物地理屏障是塑造动植物分布的基本因素，然而离散景观特征在限制微生物扩散中的作用仍知之甚少。识别划分肠道微生物群落的屏障对于模拟宿主及其共生体在物理空间和进化时间上的分布至关重要。鹿鼠（Peromyscus maniculatus复合种）栖息于北美几乎所有陆地
生物地理屏障是塑造动植物分布的基本因素，然而离散景观特征在限制微生物扩散中的作用仍知之甚少。识别划分肠道微生物群落的屏障对于模拟宿主及其共生体在物理空间和进化时间上的分布至关重要。鹿鼠（Peromyscus maniculatus复合种）栖息于北美几乎所有陆地环境，为检验哺乳动物肠道微生物组的生物地理驱动因素提供了理想模型。研究人员利用美国国家生态观测网络（NEON）生物样本库样本，采用全长16S rRNA长读长测序技术对来自美国本土13个种群的肠道微生物组进行了表征。与栖息地或气候相比，微生物类群的存在或缺失最好由东部与西部区域来解释，表明大型河流系统可能作为微生物传播的离散屏障，这可能是由于宿主扩散受限所致。尽管研究人员在整个大陆范围内观察到一致的距离衰减关系，但结果表明密西西比河与微生物物种更替增加相关，跨河 dissimilarity 超出仅由地理距离预测的水平。此外，研究人员鉴定了特定微生物谱系，其在整个大陆范围内表现出不同的距离隔离（IBD）模式，表明微生物传播模式存在梯度，从跨空间自由共享的谱系到扩散受限的谱系。总之，这些发现表明肠道微生物组可能作为景观水平生态连通性的生物指示物，揭示与大规模景观屏障相关的微生物传播不连续性，即使在缺乏生殖屏障的近缘宿主种群之间也是如此。
**研究背景与问题**
生物地理屏障如山脉、河流和海洋在塑造动植物分布与多样化中发挥基础性作用。然而，离散景观特征在限制微生物扩散方面的作用仍鲜为人知。理解地理因素如何构建宿主相关微生物群落具有重要意义：其一，微生物扩散影响宿主相关微生物组的组装与稳定性，进而影响宿主生理、免疫和疾病易感性；其二，识别微生物移动的屏障对疾病生态学具有启示意义，包括病原或有益微生物在宿主种群间的传播；其三，理解具有区域关联的微生物类群有助于揭示自然种群中微生物传播的机制。尽管越来越多的研究表明地理因素可以解释哺乳动物自然种群肠道微生物组的变异，但几个挑战限制了研究人员确定地理屏障如何影响微生物组扩散的能力：地理屏障与局部环境变异对微生物组分化的影响往往共变，难以区分；比较深度进化时间尺度上分离的宿主物种的微生物组研究面临宿主分化与地理隔离效应难以解耦的困难；大多数宿主物种地理分布范围有限，限制了在广泛空间尺度上检验景观特征如何塑造微生物组结构的能力；依赖16S rRNA高变区短读长测序的微生物组研究往往缺乏检测谱系水平传播模式所需的分辨率。因此，两个关键问题在很大程度上仍未得到检验：离散景观特征是否在微生物组组成中产生阶跃式变化，以及哪些微生物类群对这类屏障最为敏感。鹿鼠（Peromyscus maniculatus复合种）为解决这些问题提供了理想系统。鹿鼠是北美最丰富和分布最广的哺乳动物之一，占据大陆广泛的栖息地范围。该复合种的种群结构已被充分研究，密西西比河代表东部和西部种群之间基因流的主要断点。尽管存在这种种群结构，来自不同种群的个体在圈养条件下可产生可育后代。因此，东部和西部区域代表了主要的宿主种群结构和宿主移动受限，但不存在生殖隔离。同时，鹿鼠的广泛地理分布为检验局部环境因素（包括栖息地和气候）对微生物组变异的影响提供了机会。研究人员在此使用一套独立的NEON样本，结合长读长全长16S rRNA基因测序与地理距离、生物地理屏障、栖息地类型和年均温度分析，以区分连续群落距离衰减与与主要生物地理屏障相关的阶跃式更替。
**关键技术方法**
研究人员利用NEON生物样本库的68份粪便样本，来自美国本土13个采样点（县），采样点间至少间隔200 km。样本基于地理位置相对于密西西比河主河道分为东部或西部区域，年均温度基于GPS采集位置从PRISM气候数据获取，栖息地分为森林或草原。宿主基因组DNA从组织中提取，利用细胞色素氧化酶亚基1（CO1）5′区域进行P. maniculatus物种鉴定。粪便样本使用Zymo Quick-DNA Faecal/Soil Microbe Miniprep Kit提取总基因组DNA，送至ASU Desert Southwest Genomics Center进行Kinnex 16S文库制备和PacBio平台（Revio SMRT Cell）全长16S rRNA基因测序，使用通用细菌16S引物27F和1492R。生物信息学分析使用Nextflow工作流处理PacBio环形共识序列（CCS/HiFi）读长，cutadapt修剪引物，dada2流程进行质量过滤（保留1000–1600 bp、无模糊碱基、最大期望错误数≤2的序列），推断ASV并去除嵌合体，基于SILVA 138使用朴素贝叶斯分类器进行分类学注释。统计分析在R中进行，ASV表稀释至最小文库大小3771 reads/样本，使用Bray–Curtis相异度（BCD）和S?rensen相异度（SD）计算β多样性，PERMANOVA量化群落水平差异，Mantel检验评估微生物距离与地理距离的相关性，ANCOM-BC鉴定差异丰富ASV和结构零。
**研究结果**
**地理变异与肠道微生物组组成的驱动因素**：PacBio Revio全长16S rRNA测序每个样本中位数为74,973.5条质控后读长，稀释后保留22,378个ASV。微生物群落以Bacillota（72.8%）、Bacteroidota（22.4%）、Desulfobacterota（1.72%）和Campilobacterota（1.06%）为主。总体微生物组变异在BCD矩阵和SD矩阵中均显著由种群解释（PERMANOVA，R2=0.221，p=0.001）。NMDS图揭示三个主要聚类：东部聚类、西部聚类和西部区域内较小的加利福尼亚聚类。西部区域ASV丰富度均值和中位数显著高于东部区域。PERMANOVA模型包含区域、栖息地、年均温度、纬度和经度作为预测变量：对于BCD，年均温度在所有三个分类水平上解释的变异最多；对于SD，区域在所有三个分类水平上解释的变异最多。**距离衰减与微生物群落组成的离散转变**：在所有成对比较中检测到显著的距离衰减模式，SD的Mantel r=?0.449（p=0.001）强于BCD的Mantel r=?0.076（p=0.045）。东部区域内BCD和SD均与地理距离显著负相关；西部区域内同样显著。区域间比较中，BCD与地理距离呈弱但显著相关（r=?0.0377，p=0.001），而SD与地理距离的关系不显著（r=?0.0251，p=0.997）。同区域内样本对平均共享约3.0%的ASV，而不同区域样本对仅共享1.26%。在重叠地理距离范围838–1492 km内，区域间微生物相似性仍显著低于区域内。**细菌类群在美国本土的区域关联变异**：ANCOM-BC鉴定出10个ASV在东西部间显著差异丰富（q<0.05），其中4个属于Lactobacillus属，2个属于Helicobacter属，4个为未培养ASV；7个ASV在东部富集，3个在西部富集。106个ASV被鉴定为结构零，1个ASV在西部缺失，105个ASV在东部缺失。2个ASV与栖息地显著相关，FDR校正后无ASV与年均温度显著相关。在系统发育树中ASV tips数量最多的10个物种中，5个具有显著的距离隔离（IBD）模式（Lactobacillus reuteri、Clostridium fusiformis、Adlercreutzia caecicola、Clostridium leptum和Adlercreutzia equolifaciens）。Lactobacillus reuteri在西部区域显著富集，具有最多的ASV数量，并显示显著IBD。
**讨论与结论**
生物地理屏障作为动植物多样化和群落结构的驱动因素已得到充分确立，但离散景观特征是否同样限制宿主相关微生物的组成和扩散在很大程度上仍未得到检验。研究人员将经典生物地理学概念应用于大陆范围内种内宿主系统，使用长读长全长16S rRNA测序表征了P. maniculatus复合种13个种群内细菌物种的变异。三个主要模式：第一，在测试的变量中，总体微生物群落变异最好由年均温度（BCD）和区域（SD）解释，表明微生物丰度和存在/缺失受不同因素结构化。第二，微生物群落组成在东部和西部区域内均显示连续的距离衰减关系，但区域间SD趋于平稳，表明与密西西比河相关的微生物谱系更替不连续性超出仅由地理距离预测的水平。第三，微生物物种内的系统发育分析揭示细菌类群间IBD模式的实质性差异，一些在整个大陆显示强空间结构，另一些则跨地理空间广泛共享。研究人员指出，区域划分与多个测量和未测量因素相关，因此结果不能确立密西西比河本身作为微生物扩散的因果屏障；地理距离和宿主遗传结构在该系统中也相关，限制了区分其独立贡献的能力；SD可能对低流行率类群特别敏感，但仅此不能解释区域间缺乏距离衰减关系；全长16S rRNA测序不能区分16S rRNA基因序列相同的微生物菌株或捕获16S rRNA基因外的功能基因组变异。总之，研究结果表明鹿鼠肠道微生物组的生物地理学反映了在不同水平上运作的多种空间过程：微生物丰度随环境条件和地理距离变化，而微生物谱系存在/缺失显示超出距离预测的额外区域不连续性；在更细分类分辨率下，细菌物种的地理结构程度差异显著，表明其宿主种群间扩散能力的变异。这些发现将经典生物地理学原理扩展到宿主相关微生物群落，并证明全长16S rRNA测序可作为识别受扩散限制塑造的微生物谱系的可扩展方法。研究结论翻译：生物地理屏障是塑造动植物分布的基本因素，然而离散景观特征在限制微生物扩散中的作用仍知之甚少。研究人员利用NEON生物样本库样本，采用全长16S rRNA长读长测序对来自美国本土13个种群的鹿鼠肠道微生物组进行了表征。微生物类群的存在或缺失最好由东部与西部区域解释，表明大型河流系统可能作为微生物传播的离散屏障。尽管在整个大陆范围内观察到一致的距离衰减关系，结果表明密西西比河与微生物物种更替增加相关，跨河相异度超出仅由地理距离预测的水平。此外，研究人员鉴定了特定微生物谱系，其表现出不同的距离隔离模式，表明微生物传播模式存在梯度。总之，这些发现表明肠道微生物组可能作为景观水平生态连通性的生物指示物，揭示与大规模景观屏障相关的微生物传播不连续性，即使在缺乏生殖屏障的近缘宿主种群之间也是如此。
