《Molecular Ecology Resources》：A Museum-Curated, Voucher-Backed 12S Barcode Reference Library for Fishes of the Ecuadorian Amazon
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环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是一种新兴方法，有望通过鉴定物种释放到环境中的遗传物质来加快和改进生物多样性调查。eDNA方法相较传统标本调查具有诸多优势，但其有效性取决于参考文库，而对于厄瓜多尔亚马逊等高生物多样性区域而言，参考文
环境DNA（eDNA）宏条形码（metabarcoding）是一种新兴方法，有望通过鉴定物种释放到环境中的遗传物质来加快和改进生物多样性调查。eDNA方法相较传统标本调查具有诸多优势，但其有效性取决于参考文库，而对于厄瓜多尔亚马逊等高生物多样性区域而言，参考文库往往不完整、 curation不一致，且与可靠鉴定和修订分类群所需的形态学凭证标本脱节。为填补这一空白，研究人员从厄瓜多尔Aguarico、Napo和Pastaza河流域采集了约5000份鱼类标本和1500份组织，代表估计311个形态学界定物种，并构建了一个新的、严格策展的、博物馆凭证标本支撑的12S参考文库，涵盖12目、46科、171属的超过303个物种的748条条形码。当用同时采集的eDNA样品中的未知单倍型进行测试时，该文库将鉴定到物种水平的比例几乎翻倍（40.0%，而使用GenBank为21.3%）。该文库还使得能够经验性估计新的物种水平条形码阈值：全长条形码为0.4%，通用脊椎动物迷你条形码为0.9%，鱼类特异性迷你条形码为0.6%。通过连接博物馆凭证标本、更新分类学和操作可扩展性，该参考文库有助于将eDNA宏条形码从一种令人兴奋的可能性转变为理解、监测和保护亚马逊淡水生物多样性的实用工具。
**研究背景与意义**
生物分类学是理解和管护地球生命复合网络的基础，其核心步骤包括界定、诊断和命名。然而，早期物种描述往往简短肤浅，加之模式标本的退化或丢失以及多位研究者对分类历史的贡献可能相互冲突，准确鉴定生物体成为一项需要历史学、地理学、形态学和遗传学跨领域专业知识的复杂任务。自然历史博物馆作为模式标本和比较参考标本的保管者，守护着支撑分类学进步的实物证据。近年来，博物馆的传统角色日益得到冷冻遗传样品收藏的补充，每份样品在固定前均与完整凭证标本唯一关联，为现代分子分类学提供了必要基础。
DNA条形码是现代分子分类学的基石，通常为100–650 bp的短DNA序列，用于物种鉴定。在针对脊椎动物尤其是鱼类的eDNA宏条形码研究中，线粒体12S rRNA基因的短区域日益常用，因为其能从降解的环境DNA中更可靠地扩增，并在当前高通量测序平台所需的短扩增子长度下提供更优的分类分辨率。然而，脊椎动物eDNA宏条形码常受限于12S基因参考序列的相对匮乏，这一问题在热带区域尤为严峻，那里 extraordinary 多样的鱼类区系在现有12S参考文库中代表性极差。
参考文库对于DNA条形码和eDNA宏条形码不可或缺，既是决定性优势也是持续局限。许多主要DNA序列库（如GenBank和BOLD）中凭证标本的链接已断裂，即使有链接，许多凭证标本也无法定位。因此，困扰主要参考文库的猖獗误鉴定几乎无法可靠和常规地解决。除非分子与形态分类学之间日益扩大的裂痕得到弥合，且此类参考文库接受更严格的分类学审查，否则DNA序列数据库中的高错误率将持续或扩散。不幸的是，即使新兴分子方法和加速的生物多样性丧失凸显了博物馆收藏和分类学研究的重要性，全球对此类研究和机构的支持却在下降。分类学能力和收藏在物种丰富的热带区域往往最薄弱，那里许多物种未被描述且分类系统不稳定。
亚马逊盆地是世界上生物多样性最丰富的淡水生态系统，西部亚马逊是鱼类物种丰富度的中心。厄瓜多尔亚马逊虽然仅占亚马逊盆地的1%，但亚马逊覆盖了厄瓜多尔近一半领土，拥有估计680种已确认鱼类，其中许多是当地食物网的关键。 vast 生物多样性与日益增加的人为压力（包括石化开采、采矿、森林砍伐和水电大坝）的交汇使厄瓜多尔成为研究、保护和实施eDNA宏条形码等现代监测工具的关键优先区域。本研究旨在解决厄瓜多尔亚马逊eDNA宏条形码的关键障碍：区域鱼类群落鉴定良好、博物馆凭证标本支撑的DNA参考序列的有限可用性。研究目标是生成该区域淡水鱼类的分类学广泛12S rRNA参考文库，评估其鉴定环境来源12S单倍型的性能，并与GenBank中先前存在的公开参考序列比较有效性，同时估计亚马逊鱼类的de novo 12S物种分化阈值以支持eDNA数据的生物多样性推断。
**关键技术方法**
研究人员开展了以下主要工作：通过检索BOLD和GenBank数据库审查厄瓜多尔亚马逊鱼类清单中所有物种的可用序列，仅保留有凭证标本关联的12S rRNA序列；在2021年7月26日至8月15日（落水季）和2022年3月25日至4月15日（涨水季）两次野外考察中，于Aguarico、Napo和Pastaza河流域39个采样点采集约5000份鱼类标本和1529份组织，另从皇家安大略博物馆（ROM）2012年和2014年考察的博物馆凭证标本中获取补充组织样本；采用盐沉淀法提取DNA，使用V05F_898和teleo_R引物扩增约675 bp的12S基因区域，对783份标本进行条形码测序；eDNA样品使用NatureMetrics标准水生eDNA试剂盒采集和提取，采用12S-V5通用脊椎动物引物扩增约100 bp区域，在Illumina MiSeq平台测序；使用Geneious v2025.2.1和MUSCLE v5.1进行序列比对，通过spider R包的threshOpt函数计算最佳分类阈值，并使用megablast分别查询GenBank和自定义参考文库以评估鉴定效果。样本队列来源包括厄瓜多尔亚马逊Aguarico、Napo和Pastaza河流域的野外采集样品以及ROM 2012年和2014年考察的博物馆凭证标本。
**研究结果**
**厄瓜多尔分类群在现有数据库中的状况**：通过对BOLD和GenBank数据库的检索，研究人员发现与凭证标本关联的12S序列仅代表更新后Barriga（2011）厄瓜多尔亚马逊鱼类清单中151个物种。其中103条序列未报告原产国，其余序列来自六个国家：秘鲁（24）、巴西（12）、法属圭亚那（7）、日本（3）、委内瑞拉（1）和厄瓜多尔（1）。现有12S序列的凭证标本分布于全球19个博物馆或研究机构。
**De Novo条形码参考文库**：本研究从783份处理的组织样本中生成了748条新的、高质量的、可变长度（修剪后512–880 bp）12S参考序列，代表至少303个形态学界定物种。绝大多数序列与可通过ROM借阅或现场访问获取的凭证标本关联，另增加一条来自高度独特分类群（Arapaima gigas）的序列以改善原本缺失分类群的代表性。在更新后的Barriga清单报告的分类群中，新参考文库涵盖15目中的12目（80%）、53科中的46科（87%）、69亚科中的55亚科（80%）、318属中的171属（54%）和802种中的303种（38%）。考虑到约10%的参考序列目前仅鉴定到属且许多其他序列仍不确定，随着分类学研究进展，可能有超过303个物种被鉴定。在更新物种清单包含的318属中，至少63属被鉴定为科学新种或厄瓜多尔新记录。所有新生成的序列数据已在GenBank核苷酸数据库中以登录号PZ692805–PZ693550公开可用。
**物种界定**：全长12S条形码的最佳条形码阈值范围为0.4%–0.7%，累积错误率为12.6%。通用脊椎动物迷你条形码显示最佳阈值范围为0.1%–0.9%（一个错配），但伴随更高的累积错误19.9%。类似地，鱼类特异性迷你条形码 exhibit 最佳阈值范围0.6%–1.0%（两个错配），累积错误率为21.7%。因此，最佳物种界定阈值实验性设定为全长条形码0.4%、通用脊椎动物迷你条形码0.9%和鱼类特异性迷你条形码0.6%。这些阈值的选择是保守的，同时在两项测试中仍产生最低可能的累积错误。
**eDNA单倍型鉴定的分类分辨率**：本研究参考文库将更高比例的环境单倍型鉴定到物种水平（40.0%），而GenBank为21.3%；鉴定到属水平的比例也更高（61.7% vs. 54.5%）。相对于GenBank，本研究参考文库还 overall 多鉴定出19个单倍型（428 vs. 409）。相反，GenBank将更高比例的单倍型分配到科水平（88.3% vs. 81.1%）和目水平（99.8% vs. 93.7%）。使用参考文库生成的物种水平分配包括所有主要亚马逊鱼类世系的代表，包括Characiformes、Siluriformes、Gymnotiformes和Cichliformes。
**讨论部分总结**
本研究生成的748条12S条形码代表至少303个物种，将厄瓜多尔亚马逊河流、湖泊和湿地环境DNA宏条形码恢复的鱼类单倍型物种水平鉴定成功率从21.3%提高到40.0%（相比GenBank）。因此，这一新的凭证标本支撑参考文库大幅改善了12S基eDNA宏条形码作为厄瓜多尔和整个亚马逊水生生物多样性研究与保护工具的分类学覆盖度。此外，每条参考序列与由皇家安大略博物馆或厄瓜多尔国家生物多样性研究所INABIO（MECN-DP）以公共信托方式策展的专家鉴定凭证标本的关联，有助于支持该参考文库的当前准确性和长期适应性。
在数据库范围和有效性方面，本研究之前，厄瓜多尔亚马逊鱼类最全面清单（Barriga 2011）中仅152个物种（18.9%）在GenBank或BOLD中有凭证标本支撑的12S条形码，仅一条条形码报告自厄瓜多尔。当用未知eDNA鱼类单倍型测试时，新参考文库将近两倍的未知单倍型鉴定到物种，并识别出比GenBank多19个单倍型为 distinct 物种。尽管取得了这一进展，许多单倍型仍无法自信地解析到物种。这一局限可能反映了引物偏倚、短12S片段的有限分辨力、分类学和地理覆盖不完整以及该区域已描述和未描述或修订不足分类群的 extraordinary 丰富性等因素的组合。尽管本研究大幅扩展了厄瓜多尔亚马逊鱼类可用的12S覆盖度，但仍仅代表大亚马逊盆地总鱼类区系多样性的一小部分。需要持续的分类学研究与凭证标本关联的条形码相结合，以缩小这些差距并为大规模生物多样性监测和保护规划提供持久、成本高效的工具。
在分类学催化剂方面，除了将未知DNA单倍型与基于形态学鉴定凭证标本的物种鉴定关联外，本研究分类学丰富的新序列数据区域收集有助于推进分类学发现和修订。例如，数据库 features 三须鲶属Pimelodella的12个 distinct 单倍型，远超Barriga（2011）报告的2个物种。凭证标本的形态学再检查确认了与每个单倍型一致的诊断差异，凸显了亚马逊 cryptic 或未识别多样性的普遍性。相反，数据库也纠正了过度拆分的情况。例如，无齿脂鲤属Potamorhina的多个标本最初形态学鉴定为不同分类群，但显示 little 遗传分化。形态学审查确认大多数属于单一物种P. altamazonica。为到达构成参考数据库的单倍型鉴定，必须解决数十个此类差异，说明DNA条形码如何既能揭示隐藏多样性又能解决分类学不确定性。
物种界定的稳健经验阈值进一步加强了eDNA宏条形码方法的应用，特别是在需要将基于单倍型的丰富度估计与形态学 derived 估计协调时。在检查的物种中，0.4%–0.7%之间的阈值最小化假阳性和假阴性，其中0.4%代表最保守的截止值。该值与先前报告的亚马逊和其他淡水鱼类阈值密切匹配。通用脊椎动物引物常用的默认阈值1%超过了研究人员计算的最佳范围并有 inflate 错误的风险。然而，在某些阈值下累积鉴定错误率仍然相对较高，凸显了在巨型多样热带淡水系统中物种界定的固有挑战。重要的是，此处经验导出的阈值仍减少了相对于广泛应用的默认阈值的分类错误，并提供了更具区域信息量的eDNA宏条形码数据解释框架。这些结果进一步强调，条形码阈值应被视为概率分类分配的操作工具而非物种边界的绝对指标。
在生物多样性保护方面，亚马逊对快速、精确和标准化生物多样性评估的需求最为迫切，那里 extraordinary 生物多样性面临高度不足的分类学和加速的环境退化。在厄瓜多尔亚马逊 specifically，主要环境压力至少可追溯到1967年Napo河流域石油发现以来的六十年，但该国亚马逊鱼类多样性知识滞后于邻国，构成有效保护的公认障碍，也是本研究的主要动力。本研究以凭证博物馆标本为锚定的DNA条形码参考数据库为厄瓜多尔标准化、大规模生物多样性调查以及与邻国更稳健的定量比较迈出了重要一步。通过提高跨文化和政治边界的生物多样性编目的 consistent 性和可比性，参考文库应有助于阐明厄瓜多尔鱼类区系的进化和生物地理独特性，并更好地将保护规划植根于生物学现实而非分类学实践。除帮助指导国家保护优先事项和理解大规模生物多样性模式外，参考数据库有潜力帮助解决众多亚马逊鱼类物种面临的具体知识空白。eDNA宏条形码的灵敏度可能改善时空分辨率，帮助揭示关键的物种特异性生态动态，如产卵迁徙的时间和持续时间以及幼体扩散。参考文库远非取代形态学方法，而是补充它们，可能加速传统上缓慢的分类学研究和培训步伐。尽管短12S标记在鱼类和其他脊椎动物eDNA宏条形码应用中日益使用，但它们不太可能完全取代COI等更广泛的条形码系统。相反， additional 位点可能保持互补性。新兴长读长测序技术可能日益使得从环境样品和凭证标本同时测序多个条形码位点成为可能。将鱼类参考文库扩展到包括12S和COI数据应改善传统DNA条形码、eDNA宏条形码和博物馆分类学研究之间的未来互操作性。通过将分类学严谨性和标准化与操作可扩展性和更精细的时空分辨率相结合，de novo参考文库增强了eDNA宏条形码在世界物种最丰富但受威胁淡水区域之一中用于保护规划、渔业管理和环境政策的实用性。
**研究结论翻译**
本研究生成的748条12S条形码代表至少303个物种，将厄瓜多尔亚马逊河流、湖泊和湿地环境DNA宏条形码恢复的鱼类单倍型物种水平鉴定成功率从21.3%提高到40.0%（相比GenBank）。因此，这一新的凭证标本支撑参考文库大幅改善了12S基eDNA宏条形码作为厄瓜多尔和整个亚马逊水生生物多样性研究与保护工具的分类学覆盖度。此外，每条参考序列与由皇家安大略博物馆或厄瓜多尔国家生物多样性研究所INABIO（MECN-DP）以公共信托方式策展的专家鉴定凭证标本的关联，有助于支持该参考文库的当前准确性和长期适应性。通过将博物馆凭证标本、更新分类学和操作可扩展性相结合，该参考文库有助于将eDNA宏条形码从一种令人兴奋的可能性转变为理解、监测和保护亚马逊淡水生物多样性的实用工具。
