《Pigment Cell & Melanoma Research》：Females Display Greater Disease Severity in a Mouse Model of Vitiligo
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白癜风是一种自身免疫性疾病，以T细胞介导的黑素细胞破坏导致皮肤进行性脱色素为特征。疾病发病年龄各异，但通常始于青春期。性别在疾病发展和治疗结局中的差异尚未被探索。研究人员此前将应激诱导的HSP70i与脱色素过程中的免疫激活相关联，并证明HSP70iQ435A可
白癜风是一种自身免疫性疾病，以T细胞介导的黑素细胞破坏导致皮肤进行性脱色素为特征。疾病发病年龄各异，但通常始于青春期。性别在疾病发展和治疗结局中的差异尚未被探索。研究人员此前将应激诱导的HSP70i与脱色素过程中的免疫激活相关联，并证明HSP70iQ435A可使树突状细胞（DCs）耐受，从而阻止T细胞的皮肤募集和激活。在雄性和雌性白癜风易感小鼠中，研究人员探究了通过基因枪递送在不同白癜风发展阶段给予的HSP70iQ435A质粒DNA治疗的长期疗效。小鼠被随访至46周龄。雌性小鼠总体脱色素程度为雄性的1.89倍，而两者对治疗的反应成比例，且效果持续贯穿整个观察期。这一性别差异与雌性小鼠中黑素细胞反应性T细胞分泌IFN-γ显著升高相关。无论治疗间隔如何，针对该蛋白的体液应答在终点时仍可检测到。这些发现还提示早期干预可获得更大获益。
白癜风是一种以T细胞介导的黑素细胞破坏导致皮肤、毛发和黏膜进行性脱色素为表现的自身免疫性疾病。疾病可发生于任何年龄，约半数病例在20岁之前发病。白癜风影响全球约0.5%至2%的人口，不同地区患病率存在差异。虽然脱色素在肤色较深的个体中更为明显，但白癜风影响所有种族和族裔群体。渐进性脱色素使许多患者遭受污名化，尤其在白癜风可能被误认为麻风病的地区。白癜风患者更易出现抑郁、焦虑和社交恐惧症。年轻年龄是这些共病的风险因素，年龄<30岁与更大的心理社会负担相关。性别在疾病患病率或严重程度中的差异尚未被牢固确立，但一些研究支持女性中疾病发生率更高。女性中报道的白癜风诊断率较高可能归因于女性感知压力更大，而多种自身免疫性疾病在女性中更为常见，提示共享病因。因社会和美容问题寻求医疗帮助的不同倾向可能反映了疾病发展的实际差异。目前对疾病免疫病理基础的理解促进了白癜风分子靶向治疗的发展。黑色素形成涉及活性氧（ROS）的产生，引起氧化应激。细胞应激可促使黑素细胞（尤其是来自白癜风患者的黑素细胞）分泌诱导型HSP70（HSP70i）。这种应激蛋白保护细胞免于凋亡，然而分泌后，HSP70i激活树突状细胞（DCs）以增强抗原加工和呈递，导致小鼠脱色素加速。DCs在被诱导型HSP70触发时，将黑素细胞特异性自身反应性CD8+ T细胞募集到皮肤。细胞毒性T细胞随后介导黑素细胞死亡并分泌IFN-γ和其他促炎细胞因子以将额外的炎症细胞募集到该部位。对白癜风病因学的这种理解拓宽了治疗选择。HSP70i作为介导脱色素启动的蛋白的鉴定促进了对该蛋白修饰版本作为分子靶向治疗的进一步研究。通过基因枪将HSP70iQ435A质粒DNA给予白癜风易感T细胞受体转基因小鼠，通过抑制DC激活显著减少脱色素。在本研究中，研究人员质疑对HSP70iQ435A的疾病进展和长期治疗结局是否因性别而异。表达相同的导致进行性脱色素的转基因，研究人员质疑雄性和雌性是否会随时间差异化脱色素，以及疾病进展是否受HSP70iQ435A治疗的影响。为此，研究人员测量了不同年龄和疾病阶段h3TA2小鼠在接受编码HSP70iQ435A的DNA治疗后的脱色素情况，并将动物维持至46周龄。分析小鼠血清中抗HSP70血清滴度，通过免疫组织学评估皮肤免疫浸润。通过ELISA和ELISPOT分析分泌IFN-γ和IL-10的T细胞来测量T细胞活性。这些研究提供了对根据性别定义疾病严重程度和治疗反应机制的认识，可用于建议根据需要调整患者治疗计划。研究结果还可有助于为白癜风治疗的临床试验设计提出更好的方法。
研究人员开展的研究显示：在治疗前各年龄点，雌性小鼠的脱色素程度显著高于雄性。双因素方差分析显示性别（p = 2.56e?07）和时间（p < 2e?16）两个参数均有显著差异，雌性脱色素程度为雄性的1.63倍，36周治疗的小鼠自然脱色素程度为5周时的6.40倍。在5、6、8、12、20和36周治疗前的小鼠示例显示进行性脱色素，雌性更易且更广泛地脱色素。总体而言，雌性脱色素在接受HSP70iQ435A后在整个评估期内经双因素方差分析减少13%（p = 3.60e?14），而相同治疗使雄性脱色素减少15.74%（p = 2.37e?8）。虽然雄性总体脱色素较少，但接受HSP70iQ435A治疗的两种性别获得了相似的治疗获益，有趣的是，这种治疗获益在整个评估期内持续可见。在5、6、8、12、20或36周龄治疗的小鼠中，疾病早期治疗的小鼠与后期治疗的小鼠相比表现出更大的治疗获益趋势。特别是，在5、6、8和12周接受HSP70iQ435A治疗的小鼠在治疗后第11（p = 0.04）、15（p = 0.03）、17（p = 0.04）、19（p = 0.03）、21（p = 0.03）和23（p = 0.05）周显示出显著的治疗获益。在20和36周龄的较晚治疗组中未观察到这一显著治疗差异。导致小鼠获益最大的治疗起始时间在雄性和雌性之间不同。雌性在8周龄时表现出最大的治疗获益。双因素方差分析比较治疗组与EV暴露雌性显示在所有时间点上脱色素减少21.42%（p < 2e?16），同时治疗效果也受时间影响。对于雄性，最大的治疗获益出现在12周龄，双因素方差分析显示脱色素显著减少28.58%（p < 2e?16），同样受测量时间的影响（p < 2e?16）。与有色素的C57BL/6小鼠相比，在选为最大治疗获益时间点的免疫染色皮肤切片中可观察到白癜风。在所有白癜风小鼠模型终点样本中，黑素细胞丢失和T细胞浸润毛囊是明显的，表明小鼠发生了真正的白癜风，而对照皮肤毛囊中黑素细胞丰富。含黑素细胞毛囊丰度的差异在雄性和雌性之间不显著，分别为26.81%和24.52%（p = 0.73）。当分析所有可用脾细胞的结果时，按性别分开的HSP70iQ435A和EV治疗脾细胞中，来自雄性和雌性小鼠的未刺激脾细胞的IFN-γ分泌极少。然而，雌性小鼠在3 μg/mL同源小鼠酪氨酸酶肽（mTYR）刺激下持续表达更高量的IFN-γ，雌性平均为每百万细胞40.00 ng，雄性为每百万细胞14.45 ng（p = 0.048）。在3 μg/mL mTYR刺激下产生IFN-γ的细胞数量在雌性中也更多，为每10^6细胞3168个，而雄性为每10^6细胞819.2个（p = 0.024）。总体而言，IL-10的分泌主要在抗CD3/CD28珠的一般刺激后产生。雌性细胞平均产生0.38 ng/mL，而雄性细胞产生0.23 ng/mL，但两者无显著差异。在使用较年轻小鼠任一性别脾细胞进行的单独实验中，观察到的变化与雄性中显著更大的CD4+ Treg（q = 0.04）和Type 2抗原特异性T细胞（q = 0.04）群体相关，而Type 1和Type 17抗原特异性T细胞丰度无显著差异。CXCR3+ T细胞在雄性中也更为丰富（q = 0.04），但CD4-CD8-抗原特异性、CD4+或CD8+群体单独均未达到两性间显著差异的标准。抗HSP70i抗体滴度（已知可保护免于黑色素瘤发展）在治疗组和对照组中至少3份血清样本中测量，包括20周龄前或后治疗的小鼠，代表加速脱色素的起点。较近治疗的小鼠（即20周后）抗HSP70i滴度平均比EV滴度高13.11倍（p = 0.002）。值得注意的是，即使在治疗超过25周的小鼠中，抗HSP70i抗体滴度仍比EV滴度高5.85倍（p = 0.003），证明这种基因枪治疗的持久影响。用EV DNA治疗的对照小鼠在所有组中产生低于500 ng/mL的滴度。
研究方法概要：研究人员使用白癜风易感h3TA2小鼠（由h3T转基因动物与HLA-A2转基因小鼠杂交培育），在5、6、8、12、20或36周龄分组进入实验，每组12只，每性别至少3只。通过基因枪（Helios gene gun system）将包被于1 μm金珠上的HSP70iQ435A编码或空载体DNA（每次1.4 μg，每周四次，间隔6天，总剂量5.6 μg/周）递送至皮肤。通过平板扫描仪每2周评估脱色素直至45–46周龄。终点采集皮肤进行免疫组织学（抗DCT/TRP2和抗CD3双染）、脾细胞进行ELISpot（IFN-γ）和ELISA（IFN-γ、IL-10、抗HSP70抗体）分析，并通过流式细胞术（FACS）分析T细胞亚群转录因子表达（FoxP3、T-bet、GATA3、RORγt）及CXCR3表面表达。统计分析使用GraphPad Prism和R软件，采用线性混合效应模型和双因素方差分析。
研究结果：（1）脱色素在雌性白癜风易感小鼠中发展更为广泛——通过治疗前各年龄点扫描测量，雌性脱色素程度显著高于雄性，双因素方差分析显示性别和时间均有显著差异。（2）雌性脱色素多于雄性，但两者从治疗中获益相等——通过计算治疗后各时间点平均脱色素百分比，HSP70iQ435A使雌性脱色素减少13%、雄性减少15.74%，两者获益比例相似且效果持续。（3）最大治疗获益的时间具有时间和性别依赖性——早期治疗组（5、6、8、12周）在治疗后多个时间点显示显著治疗获益，而晚期治疗组（20、36周）未见显著差异；雌性在8周龄治疗获益最大（减少21.42%），雄性在12周龄获益最大（减少28.58%）。（4）脱色素与黑素细胞丢失和T细胞皮肤浸润相关——通过免疫组织学显示白癜风小鼠终点样本中黑素细胞丢失和T细胞浸润毛囊，证实发生真正白癜风，两性间含黑素细胞毛囊丰度无显著差异。（5）雄性和雌性T细胞的差异反应由不同水平的IFN-γ分泌和抑制性T细胞群体定义——通过ELISA和ELISpot显示雌性脾细胞对mTYR肽刺激产生更多IFN-γ（蛋白水平和细胞数量均显著更高），IL-10分泌无显著性别差异；通过FACS显示雄性中CD4+FoxP3+ Treg、TCR+GATA3+ Type 2抗原特异性T细胞和CD3+CXCR3+ T细胞显著更丰富。（6）疫苗诱导的抗HSP70i血清滴度随时间轻微衰减——通过ELISA测量血清抗HSP70i抗体，显示HSP70iQ435A治疗组滴度显著高于EV组，即使在治疗超过25周后仍保持5.85倍升高，证明治疗的长久效果。
讨论部分总结：白癜风的发展是一个涉及细胞毒性T细胞破坏黑素细胞的动态过程，白癜风皮肤中调节性T细胞（Tregs）相对缺乏进一步允许了这种杀伤。本研究强调了免疫病理学与性别和疾病阶段的相互作用对疾病严重程度和治疗结局的影响。许多自身免疫性疾病不成比例地影响女性，白癜风研究同样支持女性优势。女性中白癜风患病率增加可能部分归因于社会和美容关注导致更早发现，但旨在限制混杂偏倚的研究报告女性患病率比男性高25%，强化了女性优势。在 mice 中建模疾病允许更受控的比较。h3TA2小鼠模型表达TIL1383I酪氨酸酶反应性TCR转基因，在3–4周龄左右引起自发脱色素。脱色素在雌性小鼠中自然发展更为广泛，表明雌性免疫系统在白癜风中有发展更广泛和更快速疾病的倾向。临床上，这提示女性更频繁地被诊断白癜风至少部分是由于生物学上更具侵袭性的疾病进程。当前理论研究了性别间可能解释这种夸张反应的激素、遗传和免疫差异。一些研究探讨了雌激素和睾酮对免疫反应的影响。性激素也可能调节参与免疫的基因。男性中自身免疫疾病保护的另一种可能解释是Tregs存在增加和FOXP3表达增加。虽然雌性脱色素多于雄性，但两者从HSP70iQ435A治疗中获得了比例相等的获益。此外，研究人员观察到在疾病早期阶段治疗的小鼠在数周内具有显著治疗获益，而在晚期治疗的小鼠中未见此效果。因此，研究人员提出及时治疗可带来更有利的结局。最大治疗获益的时间因性别而异，雌性在8周龄治疗获益最大，雄性在12周龄获益最大。解释可能在于遗传、激素和分子生物学的复杂相互作用。研究人员通过测量脾细胞对小鼠酪氨酸酶肽或抗CD3/CD28珠的IFN-γ和IL-10表达检查了雌性加速脱色素的几种可能原因。虽然发现雌性对小鼠酪氨酸酶肽产生显著更大量的IFN-γ，但也发现雌性脾细胞通过ELISpot有显著更多产生IFN-γ的活性T细胞。这表明雌性中夸张的炎症反应主要归因于T细胞数量更多，而非每个细胞产生量更大。IL-10的产生在性别间无显著差异，表明两者同等参与缓和持续的免疫反应。IFN-γ和IL-10的测量在终点时进行，此时白癜风已进展超过疾病活动高峰且雄雌间显著差异明显。此外，这些测量反映了反应潜力而非持续免疫活性。雌性中产生IFN-γ的T细胞数量增加虽可能非白癜风特异性，但可能是T细胞介导自身免疫疾病的共同机制。免疫抑制性Treg和Type 2亚群的T细胞在雄性中更丰富，如先前报道所示，而T细胞总体可能因活动性疾病中CXCR3表达升高而更倾向于向皮肤迁移。应注意CXCR3表达对h3TA2小鼠脱色素的贡献小于IFN-γ分泌。值得注意的是，研究人员发现对HSP70iQ435A的反应在这种侵袭性白癜风模型中持久，提示短疗程可能足以限制脱色素，除非遇到新的触发因素。研究人员进一步观察到对HSP70iQ435A治疗的强健且持续的抗体反应，即使在较年轻治疗组中也是如此。这表明对治疗的持久反应以及 conferred 对黑色素瘤肿瘤细胞的保护。本研究的局限性在于小鼠未培育为每个实验组包含相等数量的雄性和雌性，但按性别分层对本研究充分处理治疗数据是必要的。本研究强调了性别间白癜风发展的差异：雌性小鼠脱色素程度更大且更迅速。研究人员发现这种增加的疾病严重程度与雌性小鼠中更多T细胞产生更高IFN-γ相吻合。最后，本文支持对HSP70iQ435A的持久反应。这些发现可为未来生物标志物开发或治疗提供信息，研究人员强调在未来的白癜风研究中按性别分层的重要性。
研究结论翻译：白癜风的发展是一个涉及细胞毒性T细胞破坏黑素细胞的动态过程。本研究强调了免疫病理学与性别和疾病阶段的相互作用对疾病严重程度和治疗结局的影响。雌性小鼠脱色素程度更大且更迅速，这与雌性小鼠中更多T细胞产生更高IFN-γ相吻合。两种性别从HSP70iQ435A治疗中获得比例相等的获益，早期治疗可获得更大获益。对HSP70iQ435A的抗体反应持久，即使在治疗超过25周后仍可检测到。这些发现可为未来生物标志物开发或治疗提供信息，并强调在未来的白癜风研究中按性别分层的重要性。
