拟南芥BOLA蛋白家族新成员BOLA1与BOLA4在植物生长及铁稳态中的冗余调控作用

《The Plant Journal》：Arabidopsis thalianaBOLA proteins, new actors in plant growth and iron homeostasis

　　

普遍存在于蛋白质中的铁-硫（Fe-S）簇支撑着众多基础生物学过程。然而，植物中参与Fe-S簇组装机器的许多蛋白质仍表征不足。本研究发现，BOLA1与BOLA4——BOLA家族中此前在多种生物中被描述为Fe-S簇组装因子的两个成员——是拟南芥（Arabidopsis thaliana）中关键的生长调控因子，并在铁稳态中发挥作用。表达分析显示，BOLA1与BOLA4在拟南芥多数组织中普遍表达。利用原生质体转染试验，研究人员还证明两种BOLA-GFP融合蛋白均定位于叶绿体和线粒体。突变体分析显示，bola1或bola4单基因敲除突变体在表型上与野生型无法区分，而bola1 bola4双突变体表现出严重的生长缺陷，包括主根早期生长停滞。值得注意的是，将野生型根系嫁接至bola1 bola4地上部可挽救该表型。铁含量定量、Perls染色及RT-qPCR分析进一步证明，bola1 bola4双突变体表现出铁分布改变及铁稳态相关基因表达的变化。总体而言，研究结果表明BOLA1与BOLA4以冗余方式维持主根生长和莲座叶发育，并且是拟南芥铁信号传导与铁分配中的关键参与者。

研究背景与问题提出

铁-硫（Fe-S）簇是嵌入蛋白质中的通用辅基，支撑光合作用、呼吸作用、叶绿素合成等众多基础生物学过程。植物中参与Fe-S簇组装机器的蛋白仍多未表征。BOLA家族是一类小型泛在蛋白，最初在大肠杆菌（Escherichia coli）中被发现，后被证实参与Fe-S簇组装途径。真核生物BOLA家族含四个成员，定位各异：BOLA1存在于除古菌和蓝藻外的所有生物中，在多数生物中定位于线粒体，但在绿色谱系中最初被描述为质体蛋白；BOLA2是唯一的胞质异构体；BOLA3仅见于非光合真核生物；BOLA4见于绿色谱系，兼具质体与线粒体双重定位。酵母与人类的BOLA1、BOLA3均参与线粒体Fe-S蛋白成熟，Δbol1bol3双突变体而非单突变体表现出Fe-S蛋白含量、蛋白脂酰化及呼吸链活性急剧下降，提示功能冗余；人类BOLA2缺失与轻度贫血及铁稳态紊乱相关，其机制可能涉及对铁调控蛋白IRP1活性的控制。植物中BOLA研究稀少，拟南芥BOLA家族含BOLA1、BOLA2、BOLA4三个典型成员及SUFE1。SUFE1可增强叶绿体半胱氨酸脱硫酶NFS2活性；胞质BOLA2被提示参与抗铁过载与氧化胁迫，但机制不明；BOLA1与BOLA4的生理功能尚未被表征，仅知二者均可挽救酵母Δbol1bol3突变体，提示其线粒体功能在拟南芥中保守，这也对BOLA1专一质体定位的既有假设提出疑问。因此，研究人员采用生理、分子与遗传学手段，评估BOLA1与BOLA4在拟南芥中的重要性与潜在作用。

主要关键技术方法

研究以拟南芥Col-0为野生型，使用T-DNA插入突变体bola1-3、bola1-4、bola4-1及CRISPR-Cas9创制的bola4-2，通过杂交获得双突变体；采用RT-qPCR与启动子驱动GUS报告基因分析表达模式；利用原生质体转染与稳定转基因植株结合共聚焦显微镜及MitoTracker、碘化丙啶（PI）标记进行亚细胞定位；通过铁含量电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量、Perls/DAB组织化学染色、嫁接实验、铁螯合还原酶（FCR）活性测定及光合色素与光合活性测定开展生理分析。

研究结果

表达分析显示，BOLA1与BOLA4转录本在所有检测组织中均有积累，BOLA4表达水平持续高于BOLA1，且二者在整个生育期均有表达；BOLA1-GUS与BOLA4-GUS融合蛋白在所有检测组织中均可检出，在根颈处次生根原基染色更强，两者表达模式无差异。

BOLA1与BOLA4显示冗余功能。单突变体生长与野生型相似，仅两个bola4突变体根系生长略减；而bola1-4 bola4-1与bola1-3 bola4-2双突变体表现严重生长缺陷，地上部与根系发育显著减弱，植株矮化，萌发后6天即在根颈下出现侧根，形成丛生根系并伴主根快速停滞。双突变体中BOLA1缺失不诱导BOLA4表达，反之亦然；以proBOLA1:gBOLA1或proBOLA4:gBOLA4互补均可恢复双突变体生长至野生型水平，证实二者功能冗余。

BOLA1与BOLA4亚细胞定位解析。此前认为植物BOLA中仅BOLA4兼具质体与线粒体定位，BOLA1局限于质体。原生质体转染显示，自身启动子驱动的BOLA1-GFP仅见于质体，而BOLA4-GFP见于质体与线粒体；将BOLA1-GFP置于强启动子UBQ10下可在质体与线粒体中检出，在bola4-1背景中以自身启动子表达亦可于两种细胞器检出。在稳定转基因植株中，BOLA4-GFP在所有检测的野生型组织表皮细胞线粒体及多种质体中均强烈检出；BOLA1-GFP在bola4-1背景下于子叶与下胚轴叶绿体及少数线粒体中检出。结果表明二者均具质体与线粒体双重定位，BOLA4为根细胞主要线粒体异构体，BOLA1仅在其缺失时可于该细胞器检出。

bola1 bola4双突变体表现组成型缺铁响应。两种基因在铁过量条件下均被诱导表达，组织分布不变。250 μmol/L Fe-EDTA处理抑制野生型生长，却轻度改善双突变体根系与莲座叶生长及鲜重，并增强其主根生长；以Fe-EDDHA重复实验得到相同趋势。双突变体根中FRO2与IRT1表达在对照条件下显著升高，铁过量下仍高于野生型，FRO2活性在铁充足条件下升高23倍；FIT与bHLH39表达亦升高。铁过量标志基因FER1在双突变体中于高铁条件下未被诱导。

bola1 bola4双突变体显示铁分布缺陷。双突变体地上部铁含量与野生型相似，但根中铁含量约为野生型一半；干燥种子中铁含量无基因型差异，提示该改变发生于萌发后。三龄幼苗两基因型无形态与铁分布差异；七龄双突变体根颈下方即出现强烈铁积累，成熟区铁积累高于野生型，而根尖分生区仅见微弱弥散信号，野生型则于根尖分生区可检出铁。这些模式在十二龄植株中持续，但在铁过量条件下减弱，并趋近野生型高铁下的分布。NAS4与FRD3在双突变体根中、OPT3在地上部于铁充足条件下表达升高，并在铁过量下维持较高水平。

根部BOLA1与BOLA4活性对正常植株发育必需。相互嫁接实验显示，仅将野生型根系嫁接至bola1-4 bola4-1地上部可恢复生长至阳性对照水平，且该挽救表型延续至成熟期，表明矮化表型源于根系中BOLA1与BOLA4功能受损，二者参与由根向地上部传递的长距离生长信号。

讨论与结论

讨论指出，铁是光合、呼吸与叶绿素合成的必需微量营养，铁缺乏与铁过量均危害植物，维持铁稳态需精确调控吸收、转运、储存与利用。部分含铁蛋白尤其是Fe-S蛋白不仅依赖铁可利用性，也参与维持铁稳态，如定位于叶绿体与线粒体的AtNEET、胞质Fe-S组装机器成员GRXS17与BOLA2。本研究首次表征BOLA2的两个旁系同源蛋白BOLA1与BOLA4。二者如BOLA2一样遍布全株表达；单突变体在铁充足条件下无重大表型差异，仅bola4根长略减，说明二者对植株存活、种子铁储存与萌发并非必需；双突变体的严重矮化与丛生根系支持功能冗余，与酵母线粒体BOL1/BOL3冗余类似。重新评估定位发现BOLA1并非仅限叶绿体，在BOLA4表达低时亦定位于线粒体，与蛋白质组学研究在拟南芥线粒体中鉴定到BOLA1肽段一致，也符合迄今研究的所有真核生物中BOLA1的线粒体靶向。BOLA4似为质体与线粒体中的主要异构体，与bola4突变体根生长略减相符；bola4突变体中BOLA1表达未被诱导，提示痕量BOLA1足以补偿，或BOLA4缺失触发BOLA1进入线粒体。双突变体表现出铁稳态多方面的显著紊乱：bHLH39、FIT、FRO2、IRT1在铁充足与过量下均被诱导，提示持续缺铁响应；根中铁含量降低，Perls染色显示根尖铁减少而根颈下强烈积累；NAS4、FRD3、OPT3表达升高；FER1在高铁下不被诱导，提示对铁过量的感知能力下降。地上部铁含量、叶色素含量与光合活性无差异，嫁接实验将缺陷定位于根部。研究人员推测根颈处大量次生根形成使该区域铁需求尤为迫切，可解释缺铁响应诱导与该区域铁强积累；高铁处理部分挽救短根与矮化表型并部分恢复类野生型铁分布。由于BOLA蛋白定位于质体与线粒体，其缺失可能导致这些细胞器内Fe-S簇组装与传递缺陷，进而广泛影响依赖Fe-S的代谢途径，与双突变体严重表型相符。拟南芥中nfu2、nfu3等质体Fe-S传递蛋白突变体表现矮化，hcf101、grxs15、nfu4、nfu5等则表现致死，说明质体或线粒体Fe-S运输受损常严重损害生长。BOLA1与BOLA4是线粒体GRXS15及质体GRXS14、GRXS16等II类GRXS的已知互作因子；grxs15-3突变体矮化表型与bola1 bola4相似，提示二者可能在同一通路中独立或协同作用于GRXS15。初步结果显示双突变体线粒体中GRXS15丰度略增，而线粒体琥珀酸脱氢酶亚基SDH2与胞质ACONITASE1丰度下降。研究结论为：BOLA1与BOLA4以冗余方式维持主根生长与莲座叶发育，是拟南芥铁信号传导与铁分配中的关键参与者；本研究重新揭示了二者的功能与细胞定位，为后续解析其是否及如何延伸至Fe-S簇同化与植物铁稳态研究提供了新视角。