两个近完成基因组揭示黄肉与白肉枇杷（Eriobotrya japonica L.）芽变导致显著果实品质差异的分子机制

《The Plant Journal》：Two nearly complete genomes reveal the molecular mechanism underlying the significant fruit quality differences caused by bud sport between yellow and white-fleshed loquat (Eriobotrya japonica L.)

　　

芽变（bud sport）是多年生果树中常见且稳定的体细胞变异。枇杷（Eriobotrya japonica L.）为常绿果树，根据果肉颜色可分为黄肉型和白肉型。为揭示其遗传基础，研究人员组装了黄肉‘洞庭’枇杷（TBY）及其白肉芽变（TBW）的两个近完成基因组。TBY和TBW的最终组装大小分别为773.29 Mb和728.86 Mb，contig N50分别为31.87 Mb和28.63 Mb。比较基因组学分析表明，TBY的杂合率接近TBW的两倍（0.53% vs. 0.27%）。整合多组学和分子标记检测结果揭示，EjPSY2A^d/EjPSY2A^d等位基因的纯合是TBY果肉颜色由黄变白的原因。此外，EjSUSs（?1、?2、?3、?12）和EjSPS3可能分别是导致TBY和TBW果肉中己糖和蔗糖显著积累的关键基因。再者，TBY中EjC4H8和Ej4CLs（?7、?10、?20）的高表达可能导致其果肉中更多木质素的积累。综上所述，这些发现为黄肉与白肉枇杷之间的分子机制差异提供了有价值的见解，并突出了芽变作为果树新种质资源创制有价值途径的重要意义。

**研究背景与立题依据**

芽变是多年生果树中常见且稳定的体细胞变异形式，因其在保留母本优良品质的同时产生新表型，对果树和园艺作物的新品种选育具有重要意义。然而，芽变导致果实品质显著差异的内在分子机制在全基因组水平上仍知之甚少。枇杷（Eriobotrya japonica L.）属于蔷薇科常绿果树，依据果肉颜色及甜度、硬度可分为黄肉型和白肉型。黄肉枇杷的橙红色主要源自丰富的类胡萝卜素（carotenoids），而白肉枇杷以其细腻乳白的果肉、柔嫩质地和多汁甜味深受消费者青睐。一般认为白肉枇杷由黄肉枇杷突变而来，但其内在遗传机制尚未被充分阐明。此前研究人员报道了黄肉‘洞庭’枇杷（TBY）衍生出的白肉芽变（TBW），两者在糖组分、果肉质构和抗寒性等方面存在显著差异，且通过高密度分子标记检测和多年嫁接后代跟踪观察证实了TBW芽变的稳定性。然而，两者在果肉颜色、风味和质地上的显著差异仍无法得到有效解释，这促使研究人员通过比较基因组学进一步探究其遗传信息变异。

**关键技术方法**

研究人员首先对TBY和TBW进行基因组调查与流式细胞术评估基因组大小，利用PacBio CCS测序和Hi-C技术组装染色体水平近完成基因组，并采用BUSCO评估组装完整性。通过比较基因组学鉴定结构变异（SVs）和杂合性缺失（LOH）区域。对S1（143 DAP）、S2（150 DAP）和S3（155 DAP）三个关键发育时期的果肉进行转录组测序（RNA-Seq），结合靶向代谢组检测类胡萝卜素、糖组分和苯丙烷类化合物。利用WGCNA筛选关键基因，RT-qPCR验证转录组数据准确性，并通过瞬时过表达进行基因功能验证。此外，采用分子标记对EjPSY2A进行基因分型，并通过组织化学染色和试剂盒测定木质素含量。

**研究结果**

**基因组组装、注释与比较分析**：研究人员在四川阿坝藏族羌族自治州发现TBW芽变及其母本TBY。基因组调查估计TBY和TBW的基因组大小分别为750.60 Mb和724.27 Mb，流式细胞术结果相当。值得注意的是，TBY的杂合率为0.53%，接近TBW（0.27%）的两倍。整合56.97 Gb PacBio CCS序列和167.72 Gb Hi-C数据，最终获得TBY（773.29 Mb）和TBW（728.86 Mb）的基因组组装，contig N50分别为31.87 Mb和28.63 Mb，每条染色体平均仅近两个gap。BUSCO分析显示TBY和TBW组装中分别有99.13%和99.19%的核心真核基因完整。基因组注释分别鉴定到47 530和43 915个蛋白编码基因模型。以TBY为参考，在TBW中鉴定到30个倒位、271个易位、101个参考特异性重复、897 290个SNP和135 466个Indel。全基因组LOH分析在TBW中鉴定到1461个LOH区块，覆盖约335.4 Mb。

**TBY与TBW关键时期的比较转录组分析**：研究人员在143 DAP（S1）、150 DAP（S2）和155 DAP（S3）三个时间点采集果肉样品进行转录组分析，分别在S1、S2和S3阶段检测到1678、3055和4299个差异表达基因（DEGs），表明转录水平差异随果实成熟逐渐增大。KEGG分析显示不同阶段富集到"淀粉和蔗糖代谢""类黄酮生物合成""苯丙氨酸代谢""类胡萝卜素代谢"等通路。GO分析检测到"碳水化合物代谢过程（GO:0005975）""对胁迫的响应（GO:0006950）""对热响应（GO:0009408）""对辐射响应（GO:0009314）""对温度刺激响应（GO:0009266）"等生物学过程条目。

**导致枇杷果肉颜色变化的核心类胡萝卜素组分**：总类胡萝卜素随果实发育逐渐增加，β-胡萝卜素与色相角呈显著负相关。通过UPLC-MS鉴定到12种类胡萝卜素组分，其中E/Z-八氢番茄红素和β-胡萝卜素含量在TBY与TBW间差异最大，均超过10倍。ABA含量在TBW中高于TBY。WGCNA分析鉴定到EjPSY2A为果肉中高表达的特异性PSY同源基因。序列分析表明TBW中EjPSY2A存在321 bp缺失，导致翻译提前终止，与先前报道的EjPSY2A^d一致。分子标记检测表明EjPSY2A基因在TBY中为杂合状态而在TBW中为纯合状态。瞬时过表达EjPSY2A可恢复TBW果肉中β-胡萝卜素的积累，而瞬时过表达EjNCED2则降低TBY果肉中β-胡萝卜素的积累。

**TBY与TBW糖组分的动态变化**：PCA结果表明果肉糖组分的显著变化发生在S3阶段。共检测到8种糖组分，其中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇为枇杷果肉的四种主要糖组分。随着果实成熟，两个材料中山梨醇含量下降而果糖和葡萄糖含量增加，S3阶段蔗糖、果糖和葡萄糖含量差异显著（P < 0.01）。转录组与糖代谢联合分析表明，四个EjSUSs（?1、?2、?3、?12）在TBY中高表达，而三个EjSPSs（?3、?4、?6）在TBW中高表达。EjHxK在TBW三个时期均高表达。两个EjSDH（EjSDH10和EjSDH14）在TBY中高表达，而两个EjFRK（EjFRK3和EjFRK4）、五个EjGPI和两个EjPGM在TBW中高表达。

**TBY与TBW苯丙烷类组分的动态变化**：与糖和类胡萝卜素不同，PCA结果显示苯丙烷类差异随果实发育逐渐减小。共鉴定到12种苯丙烷类化合物，其中原花青素和表儿茶素含量最丰富，占比超过90%。丁香醛（木质素降解产物）仅在TBY中特异性检测到。联合分析检测到EjC4Hs（EjC4H7和EjC4H8）和Ej4CLs（?7、?10、?20）在TBY中高表达。组织化学染色和木质素测定证实TBY果肉中木质素含量高于TBW，这可能解释了TBY果实硬度高于TBW的原因。

**讨论与结论**

研究人员组装了两个近完成枇杷基因组，每条染色体平均仅两个gap，contig N50较此前最佳版本提高5.64至6.27倍。基因组调查显示TBY杂合率接近TBW的两倍，LOH分析证实TBW基因组中存在丰富的LOH区域，类似于苹果和桃芽变材料中报道的突变机制。四川藏区高海拔、强紫外辐射和剧烈昼夜温差等极端条件可能通过同源重组（HR）修复DNA双链断裂（DSBs）导致LOH驱动的芽变事件。研究人员证实EjPSY2A/EjPSY2A^d位点位于11号染色体的LOH区域内，TBY中的EjPSY2A/EjPSY2A^d可能通过HR修复DSBs突变为TBW中的EjPSY2A^d/EjPSY2A^d，从而阐明了白肉枇杷的起源。此外，尽管TBW中EjPSY2A的C端截断改变了编码蛋白，但其转录本丰度并未降低，升高的表达水平可能代表对类胡萝卜素生物合成减少的补偿性转录响应。等位基因特异性表达（ASE）也可能解释TBY与TBW之间大量DEGs的存在。研究结论指出：芽变为果树产生丰富的遗传变异，已成为果树最重要的育种途径之一。本研究利用从头组装的高质量基因组系统表征了芽变体TBW与其野生型之间的遗传变异特征，整合分析阐明了调控类胡萝卜素、糖和苯丙烷代谢途径的关键代谢物及分子机制，证实了由杂合EjPSY2A/EjPSY2A^d位点转化而来的纯合基因型EjPSY2A^d/EjPSY2A^d是TBW白肉表型的主要因果因子。该研究为解析果树芽变的可遗传分子机制提供了有价值的见解和新发现，有助于深入理解和实际应用基于芽变的育种策略。