《The Plant Journal》：Population genomics of heterosporous lycophytes: allopatric speciation and historical persistence through paleoclimatic fluctuations
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物种形成是驱动地球生物多样性起源的基础过程。尽管物种形成机制已在许多植物类群中被揭示，但异孢石松类植物的演化动力学仍 largely 未被探索。本研究以卷柏属 sanguinolenta 组（Selaginella sanguinolenta group）为模
物种形成是驱动地球生物多样性起源的基础过程。尽管物种形成机制已在许多植物类群中被揭示，但异孢石松类植物的演化动力学仍 largely 未被探索。本研究以卷柏属 sanguinolenta 组（Selaginella sanguinolenta group）为模式系统，该组包含东亚7个山地物种。研究人员为 S. aitchisonii 构建了高质量染色体水平参考基因组，对49个居群的191个个体进行了全基因组重测序，并整合了群体基因组学、系统发育基因组学、形态学和生态学分析。结果表明，中新世古地理事件驱动的强烈地理隔离导致了高遗传分化和有限的种间基因流。异孢性（heterospory）与独立配子体世代（independent gametophyte generations）的独特组合可能加剧了极端近交（extreme inbreeding），进一步阻碍了这些谱系跨越地理屏障的能力。生态位分化（ecological niche divergence）表明这些物种承受着异质性选择压力；此外，选择性清除（selective sweeps）、叶排列变异和功能基因分化的证据表明自然选择产生了具有环境适应性性状的新物种。人口统计学重建（demographic reconstructions）揭示了从中中新世到上新世共同的扩张后收缩至瓶颈（bottleneck）的轨迹。山地避难所（montane refugia）可能在物种存续中发挥了作用，为四个物种自末次间冰期（Last Interglacial）以来的冰后期扩张保留了遗传多样性。研究人员得出结论：S. sanguinolenta 组自中新世以来经历了异域物种形成（allopatric speciation），并成功存续通过了第四纪剧烈的气候波动，这为基于群体基因组学分析理解早期分化维管植物的演化提供了新的见解。
**研究背景与问题**
物种形成是驱动地球生物多样性起源与维持的基础过程，一直是演化生物学的核心研究目标。近年来大规模基因组测序技术的进步使研究人员能够在多种植物谱系中探讨这一经典问题，例如被子植物中的红树、裸子植物中的松属、蕨类中的桫椤科以及苔藓中的泥炭藓属。然而，石松类植物作为最早的陆生维管植物，是真叶植物（包括蕨类和种子植物）的姊妹群，在这一研究背景下明显被忽视。在已识别的1300余种石松类植物中，超过70%为异孢类型，同时产生大孢子和小孢子。该谱系是三类异孢谱系（卷柏属和木贼属所在石松类、水生蕨类、种子植物）中最古老的一支（起源于晚泥盆世），其异孢性被视为陆生植物的重要创新性状。值得注意的是，与配子体完全依赖孢子体的种子植物不同，异孢石松类保留了独立的配子体世代。尽管具有深远的演化意义，该独特类群物种形成的具体机制及其存续至今的策略仍 largely 未解决。
地理隔离被广泛认为是物种形成的首要驱动力，因为物理屏障阻止基因流，使居群通过突变、自然选择或遗传漂变积累遗传分化。在隔离梯度上，三种主要情景被认可：异域、邻域和同域物种形成。其中异域物种形成研究最为频繁，通常由地壳运动或冰川作用引起，在山地景观分布的植物谱系中尤为普遍。然而，不完全的地理隔离不一定表明物种形成过程的减弱。当前证据表明，杂交和伴随基因流的物种形成也可在新物种形成和生物多样性产生中发挥关键作用，特别是在分布重叠或具有长距离种子传播或风媒传粉机制的类群中。由于地理隔离在传统石松类研究中并非焦点，孢子传播更多在定殖相关研究中被考察，因此对其在石松类物种形成中的作用，特别是异孢性伴随独立世代如何影响地理隔离和基因流，理解有限。
自《物种起源》发表以来，自然选择一直被认定为演化的核心过程。一般而言，趋异自然选择驱动居群间遗传和表型性状变异的积累，这些变异增强适应性并强化基因流屏障，生殖隔离可能作为副产物产生。近期的生态选择理论强调，栖息地差异驱动的趋异选择可直接促进基因组分化并限制基因流，最终在没有严格地理屏障的情况下塑造新物种。相反，自然选择的特定轨迹常与独特表型的出现强烈相关。在石松类物种中，已有研究识别了若干促进极端环境适应的形态和生理创新，显著例子包括卷柏（Selaginella tamariscina）耐干旱复苏的复杂基因调控网络以及 S. erythropus 适应低光生境的杯状双型叶绿体。然而，形态或遗传机制与环境之间的联系很少如此直观；自然选择压力是复杂而微妙的，特别是在形态相似、近缘的物种间。至少对石松类而言，自然选择如何贡献于更广泛的物种形成案例仍未探索。
此外，物种形成并非演化终点。大多数现存植物谱系在第四纪早期或之前分化，表明其悠久历史。自初始分化以来，植物物种可能持续被深刻的古环境事件塑造，包括剧烈的气候波动、生物互作变化乃至大灭绝。因此，其居群大小、地理分布和遗传结构可能通过扩张与收缩、瓶颈和迁移反复变化，且常协同作用。特别是第四纪气候振荡已被证明驱动广泛的分布区收缩和向避难所退缩，避难所作为生物多样性储库促进了冰后期再定殖。值得注意的是，石松类植物历经地质时间尺度上的大灭绝事件而存续。阐明其物种形成后的存活机制可能为长期谱系演化机制提供宝贵见解，最终为面对持续全球气候变化的保护和管理工作提供信息。
本研究特别关注卷柏属 sanguinolenta 组作为代表性类群，属于异孢石松类中多样性最丰富的卷柏科。基于先前研究，该物种组被认为是早期维管植物中最早的多倍体起源谱系（早三叠世），经历了长期的二倍化演化，冠群分化于中新世。最新的物种界定研究识别了该组7个物种，包括两个广布种：S. aitchisonii、S. jacquemontii；以及五个窄域分布种：S. baodongii、S. nummularifolia、S. rossii、S. sajanensis、S. sanguinolenta，均分布于从喜马拉雅到西伯利亚的山地地区，生境条件多样。研究人员提出了三个具体问题：（i）地理隔离和自然选择在其物种形成中扮演什么角色？（ii）自物种形成以来它们经历了哪些人口统计学事件？（iii）异孢性或独立配子体世代对物种演化和发育过程是否有特殊影响？
**关键技术方法**
研究人员对 S. aitchisonii 进行了基因组调研、PacBio HiFi 测序和 Hi-C 测序，采用 hifiasm 组装、purge_haplotigs 去冗余、Juicer 和 3D-DNA 进行染色体锚定，使用 BUSCO 和 LAI 评估组装质量。对来自49个居群的191个个体进行全基因组重测序（Illumina NovaSeq 6000平台），使用 BWA-MEM 比对、GATK v4.4 进行变异检测。群体结构分析采用 NJ 树、ADMIXTURE 和 PCA；系统发育分析使用 IQ-TREE2、SVDquartets、SplitsTree 和 TWISST；基因流分析采用 Dsuite（ABBA-BABA 检验）、TreeMix 和 Nm 计算；种群历史动态采用 SNAPP 分化时间估计、PSMC 有效居群大小推断和 MaxEnt 物种分布模型。此外进行了形态学观察、生态位重叠统计、Mantel 检验（IBD/IBE）、Tajima's D 和 Fay and Wu's H 中性检验以及 GO 功能富集分析。凭证标本保存于中国科学院植物研究所标本馆（PE）。
**研究结果**
**基因组组装**：研究人员获得了 S. aitchisonii 的染色体水平基因组，最终组装大小为134.83 Mb，锚定于10条假染色体。BUSCO 分析显示89%的胚胎植物保守基因完整，LAI 值为18，达到参考基因组水平。基因组包含47.3%的重复序列，预测了26 089个基因，其中22 588个具有功能注释。
**全基因组重测序与SNP检测**：研究人员从7个物种191个个体中产生了1171.8 Gb的原始重测序数据，经过严格过滤后获得18 633 942个高质量SNP。
**群体结构**：基于NJ树、ADMIXTURE和PCA的分析表明，7个单系物种聚为三个主要分支。Clade I 包含五个窄域分布种，Clade II 和 Clade III 分别为广布种 S. aitchisonii 和 S. jacquemontii。两个广布种均显示出与地理分布密切相关的种内结构。AMOVA显示物种间遗传变异占30.82%，物种内居群间占10.74%，居群内占58.43%（P < 0.05）。
**遗传多样性与分化**：该物种组的遗传多样性相对较低，总体核苷酸多样性（π）为0.014 ± 0.011。居群内观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）均较低，近交系数（F）高达0.813 ± 0.157。种间固定指数（FST）范围为0.47至0.67，绝对核苷酸分歧度（dXY）范围为0.03至0.047，表明物种间高度遗传分化。
**系统发育关系与基因流**：不同方法构建的系统发育树在物种水平上拓扑结构明显不一致。SVDquartets 和 TreeMix 树支持 S. aitchisonii 与 S. jacquemontii 以及 S. rossii 与 S. sanguinolenta 的姊妹种关系，而 IQ-TREE 树解析为阶梯式分化。Dsuite 分析检测到7个显著的弱基因流信号，f-branch 分析显示与 S. jacquemontii 相关的中等历史渐渗。TreeMix 识别了两个最优迁移事件，解释99.8%的方差。种间 Nm 值极低，范围为0.12至0.32。
**形态变异**：研究人员考察了7个物种的营养叶排列变异，识别出三种横截面类型：纺锤形（S. nummularifolia）、圆方形（S. aitchisonii、S. sanguinolenta、S. jacquemontii）和水平H形（S. rossii、S. sajanensis、S. baodongii、S. jacquemontii）。
**生态位分化**：生态位重叠统计（Schoener's D：0.12–0.53；Warren's I：0.21–0.65）表明种间生态位重叠为低至中等水平。方差分析显示所有评估的环境类别在7个物种的栖息地间均存在显著差异。S. nummularifolia 占据独特的生态位极端，表现出最强的生态分离。
**基因组分化驱动因素与选择特征**：Mantel 检验揭示了显著的 IBD（rs = 0.53，P < 0.001），但控制地理距离后 IBE 效应完全不显著（rs = 0.019，P = 0.400），表明初始的弱 IBE 信号是空间自相关驱动的统计假象。Tajima's D 统计量为负值（?0.721 ± 0.427），Fay and Wu's H 未显示显著的正选择信号。基于 Z 标准化 FST 识别了269个高度分化基因组窗口（前2%），GO 功能富集分析在 BH 校正后保留了221个显著术语（115个独特术语）。
**种群历史动态**：SNAPP 分化时间估计表明7个物种的分化发生在上新世之前。PSMC 推断显示所有7个物种的有效居群大小在4–3百万年前达到峰值后急剧下降并经历瓶颈。随后四个物种在晚更新世（0.7–0.2百万年前）有效居群大小反弹，而其余三个物种维持小而稳定的有效居群大小。MaxEnt 物种分布模型显示模拟的高度适宜古栖息地从海洋同位素阶段M2（约3.3百万年前）持续减少，至末次冰盛期结束时退化为破碎状态，目前有一定程度恢复。
**讨论与结论**
基于研究发现，S. sanguinolenta 组的7个物种可能自中新世以来经历了由地理隔离引发的异域物种形成，随后自然选择驱动了环境适应。物种形成后，它们经历了剧烈的种群统计波动：扩张、收缩、瓶颈以及若干物种从晚中新世–上新世至今的二次扩张。
关于物种形成的起始，研究人员的野外调查显示当前物种居群高度破碎化分布，被陡峭山峰或深谷隔开，迄今未观察到同域居群或杂交带。与地理隔离一致，研究人员发现了清晰的种间遗传结构和高度遗传分化，IBD 分析的正相关表明地理距离主要驱动遗传分化。这些发现支持经典的异域物种形成模型。关于特定隔离如何产生，研究人员认为该组物种分化并非近期事件，从晚渐新世至早中新世开始，于早上新世完成，与喜马拉雅碰撞造山运动等东亚新生代重大地质事件的时间线吻合。最早的物种形成驱动力可能是萨彦地区晚中生代至早新生代的新构造运动。S. nummularifolia 在喜马拉雅东缘和雅鲁藏布江流域的分化可能与喜马拉雅快速隆升结束（约23–19百万年前）及河流演化有关。S. aitchisonii 和 S. jacquemontii 的物种形成可能不早于中中新世（约13百万年前），支持了分化时间估计结果。在欧亚大陆东缘（阿穆尔板块），晚中新世至早上新世分化出三个物种，中新世–上新世界线的气候转变导致海平面上升和水位变化，可能最终阻断了基因流的陆路通道。
关于自然选择的作用，研究结果表明环境异质性并非限制基因流的主要屏障，自然选择而非生态物种形成驱动了新物种的局域环境适应。不同叶排列与生态位梯度密切对应：S. nummularifolia 的纺锤形横截面适应开阔岩石山坡的高太阳辐射、高海拔和高土壤盐分环境；S. rossii 等的水平H形横截面适应较湿润的低海拔河谷；S. aitchisonii 和 S. sanguinolenta 的中间形态反映了凉爽、中等湿润的过渡带生境。Tajima's D 和 Fay and Wu's H 表明该组近期居群增长或处于弱正选择下。两个广布种显示出更明显的受选择倾向，而五个窄域种更可能经历了居群缩小和/或平衡选择。GO 富集分析揭示了物种对间生物过程的显著分化，蛋白质修饰过程和高分子修饰在多数物种对中一致识别，这些调控过程在植物响应各种环境胁迫中具有关键作用。
关于种群收缩与存续，研究人员将种群历史动态划分为三个阶段：阶段I（晚中新世–早上新世），所有7个物种有效居群大小逐渐扩张；阶段II（晚上新世–早第四纪），有效居群大小不同程度下降，可能受海洋同位素阶段2全球异常降温影响；阶段III（更新世），7个物种在剧烈气候波动中逐渐达到瓶颈，仅4个物种在晚更新世发生显著扩张。SDM 结果与 PSMC 估计基本一致。遗传多样性较高的居群位于 SDM 识别的适宜生境内，主要集中于30°N–45°N（新疆和中国西北），可推断为气候波动期间的潜在避难所。山脉虽然阻隔基因流，但也可能作为西伯利亚冷锋的天然屏障。
关于异孢性与独立配子体世代的影响，研究发现这些物种表现出高度隔离和极端近交的遗传模式。居群遗传变异低、近交系数高，S. sanguinolenta 组物种的F值接近1，表明趋向极端自交而非交叉与自交混合。这与同孢蕨类和苔藓植物形成鲜明对比，后两者具有广泛的遗传连通性和最小的遗传结构，主要归因于其通过大气环流长距离传播和从单个孢子建立居群的能力。尽管卷柏缺乏有效的长距离主动传播能力，但通过风和大气环流的被动传播仍然可行。研究人员假设这种模式可能源于卷柏中的"联孢子传播"机制，即大孢子和小孢子通过互补纹饰粘附，可能促进不同性孢子近距离着陆用于繁殖来源于同一母体，从而强烈促进自交。此外，与风媒传粉的种子植物相比，后者的花粉传播在机制上类似于孢子传播，但广泛的基因流在相对远距离的居群间并非罕见。相比之下，配子体的独立性可能使这些生物在定殖方面处于明显劣势，其对水的依赖意味着大孢子及其萌发配子体必须处于有利于成功萌发和受精的环境中。总之，研究人员提出异孢性与独立配子体的组合在初始地理隔离后严重加剧了卷柏的极端近交，从而进一步加速了这些谱系间的异域物种形成过程。
关于复杂演化历史与研究局限，研究人员初步排除了异常核突变率和广泛杂交作为拓扑不一致的主要驱动因素。拓扑统计显示两个次要不一致树拓扑的频率高度对称（约1:1比例，如14.18%对12.83%），这是不完全谱系分选（ILS）的预期特征。S. sanguinolenta 组可能的古代杂交起源可能提供了广泛 ILS 所需的丰富祖先多态性。东亚集中而混乱的地质事件可能触发了该组非典型的快速辐射，短的内节点时间导致深度溯祖事件，从而驱动严重的系统发育不一致。此外，随着拓扑复杂的东亚景观快速破碎化，祖先分布区被强制分割为多个隔离区块，由此产生的物理隔离容易被动建立奠基者效应。渐渗检验检测到的潜在基因流信号可能代表两种机制不同的情景：一是复杂人口统计学过程混淆渐渗检验的分析假象（如未解决的 ILS、历史瓶颈或幽灵谱系），二是完全地理隔离之前发生的古代网状演化。
研究结论指出，S. sanguinolenta 组自中新世以来经历了异域物种形成，并成功存续通过了第四纪剧烈的气候波动。该研究基于群体基因组学分析为早期分化维管植物的演化提供了新的见解，强调了异孢性与独立配子体世代组合在加剧极端近交和维持种间隔离中的关键作用，并揭示了山地避难所在物种长期存续中的重要性。未来研究应纳入更复杂的网络模型进行系统发育基因组学分析，并扩展到其他多样性丰富的石松类类群，以确定所观察到的独特演化机制是否代表异孢性伴随独立配子体谱系应对深刻地质和气候变化的普遍演化规律。
