《Nature Cardiovascular Research》：Comprehensive m6A landscape from direct RNA sequencing reveals SYNPO2L RNA isoform regulation mechanisms in heart failure
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越来越多的证据表明，表观转录组调控，尤其是m6A修饰，参与心脏衰竭（heart failure）的进展。然而，修饰动态尚未在碱基分辨率和转录本异构体水平上进行映射和研究。本研究采用Nanopore直接RNA测序（direct RNA sequencing, D
越来越多的证据表明，表观转录组调控，尤其是m6A修饰，参与心脏衰竭（heart failure）的进展。然而，修饰动态尚未在碱基分辨率和转录本异构体水平上进行映射和研究。本研究采用Nanopore直接RNA测序（direct RNA sequencing, DRS）在小鼠心脏衰竭模型中，以转录组全局和位点特异性分辨率描绘m6A重塑图谱。研究人员鉴定了数千个差异甲基化位点，这些位点具有不同的序列基序（motif）并与RNA调控和心脏功能过程相关。跨物种比较揭示了小鼠和人类心脏衰竭中保守的m6A调控特征。异构体分辨分析进一步发现了涉及SYNPO2L转录本中异构体转换和m6A调控的共/转录后调控事件。在机制上，m6A修饰、替代启动子使用及相关调控元件共同解释了这一现象。总体而言，本研究提供了心脏衰竭中m6A全景及其重塑的全面、高分辨率表征。异构体水平的调控体现了RNA表达和修饰中一种尚未被充分认识的关键塑造作用。
研究背景：心脏衰竭是一种以心脏结构和功能异常、利钠肽水平升高及心源性肺循环或体循环淤血为特征的临床综合征。心肌病是心脏衰竭的主要 underlying 病因，心肌结构和功能的改变导致收缩或舒张功能障碍，在缺乏及时适当干预的情况下促进疾病进展。转录组调控已被公认是心脏衰竭进展的基础，包括胎儿基因异构体的再激活、能量代谢基因表达的 alteración 以及炎症和纤维化基因的上调。相比之下，表观转录组调控在心脏衰竭中的作用近年来才受到关注。表观转录组学指RNA分子上化学修饰的集合，调控剪接、稳定性、定位和翻译。其中，N6-甲基腺苷（m6A）是心脏生物学中研究最为广泛的修饰。关键调控因子包括写入酶甲基转移酶样3（METTL3）和擦除酶脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO），在调节心脏功能中发挥关键作用。在心脏衰竭过程中，m6A既被视为潜在生物标志物，也被认为是心脏重塑和稳态的贡献因素。m6A主要安装在共识序列5′-DRACH-3′内，其中中央腺苷是甲基化靶标。MeRIP-seq（m6A RNA免疫沉淀测序）依赖基于抗体的修饰RNA片段富集，通常鉴定跨越50–200个核苷酸的m6A峰。这种半定量方法缺乏碱基级分辨率，限制了精确位点鉴定和差异修饰分析。Oxford Nanopore Technologies（ONT）直接RNA测序（DRS）能够对天然全长RNA分子进行高通量测序。DRS检测RNA链通过纳米孔时的电流波动，这些信号可被解码以在单核苷酸分辨率下鉴定RNA修饰。这一精度水平促进了高分辨率位点特异性修饰的下游研究，并允许发现RNA修饰与RNA异构体多样性之间的关系。RNA修饰与异构体特异性调控相关。替代剪接、启动子使用和多聚腺苷酸化产生具有不同编码潜力、非翻译区和调控特性的异构体。m6A沉积的位点特异性差异可能有助于转录本变体的差异调控。然而，先前关于心脏m6A全景的研究依赖短读长测序，限制了全长异构体分辨率和修饰信号对特定转录本的分配。因此，m6A修饰与RNA异构体动态之间的相互作用仍未完全阐明。在本研究中，研究人员将Nanopore DRS与湿实验相结合，表征小鼠心脏衰竭模型中的全局m6A分布和差异甲基化区域（DMR）位点。跨物种比较探索保守调控模式，而转录本异构体分析在异构体水平鉴定共/转录后调控。本研究提供了高分辨率心脏m6A图谱，为心脏衰竭的靶标鉴定和治疗开发提供了有价值的见解。
关键技术方法：研究人员采用横向主动脉缩窄（TAC）手术构建小鼠心脏衰竭模型（27G和30G两种缩窄程度），使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠。人类心脏样本包括扩张型心肌病（DCM）患者左心室心尖部活检标本和非衰竭健康供体样本。关键技术方法包括：Nanopore直接RNA测序（DRS）结合Dorado碱基识别进行m6A位点检测；GLORI（乙二醛和亚硝酸盐介导的未甲基化腺苷脱氨）结合PCR和Sanger测序进行m6A位点验证；液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）定量mRNA修饰水平；MeRIP-qPCR验证m6A富集；人类多能干细胞衍生心肌细胞（hSC-CM）用于功能实验；荧光素酶报告基因实验检测启动子活性；放线菌素D mRNA稳定性实验；以及差异转录本使用（DTU）分析。
研究结果：
严重程度依赖性心脏表型和转录组重塑：通过超声心动图评估TAC术后2周和4周的心脏结构和功能，发现30G小鼠功能下降和腔室扩张较27G更为显著，HW/BW比值在30G中较27G高1.6倍，LW/BW比值仅在30G中显著增加。DRS鉴定出Nppa、Nppb、Acta1、Myh7和Postn为差异表达基因（DEG）。30G小鼠表现出1,721个独有DEG，而27G仅97个。30G独有上调DEG富集于炎症反应、血管形态发生和细胞外基质组织，下调DEG富集于金属离子转运、循环系统过程和脂肪酸代谢。
表观转录组分析揭示心脏衰竭中差异m6A调控：质谱检测显示全局m6A水平显著升高（27G中9.0%，30G中22.6%）。在27G小鼠中，Fto显著下调至0.83倍。在30G小鼠中，Mettl16上调至1.16倍，Fto和Alkbh5分别下调至0.82和0.88倍。Western blotting显示30G小鼠中METTL3和METTL14蛋白分别显著上调1.33和1.32倍，ALKBH5显著上调1.54倍，FTO呈下降趋势（P=0.058）。
心脏全局m6A分布模式：Dorado的DRACH上下文模型产生更多高置信度调用（>0.9）。GLORI验证了DRS m6A注释，Igf1r两个位点的DRS平均修饰比例为17%和50%，对应GLORI A/G比例为15%和50%。高（>0.4）、中（0.1–0.4）和低（<0.1）修饰水平位点分别约占5%、8%和87%。GGACU基序显示最高高修饰概率。UGGACUG是最频繁的基序。高修饰位点倾向于在转录本内聚集并优先定位在结构可及区域。
DMR位点和富集通路：在27G小鼠中鉴定出698个显著上调和637个显著下调m6A位点，在30G中鉴定出1,587个上调和1,169个下调m6A位点。单个DMR位点的甲基化变化与对应基因表达变化无全局相关性。27G中上调m6A位点最频繁基序为AAACA，30G中上调位点前两位基序为GGACA和GGACU，下调位点以GGACU为主。GO分析显示含上调m6A位点的转录本富集于RNA输出、转录后基因调控以及心肌发育、形态发生和肥大等过程。
小鼠与人类心脏衰竭间保守m6A模式：转录本水平比较鉴定出30G小鼠上调m6A位点转录本与人类衰竭心脏富集峰转录本之间227个重叠转录本。位点水平比较显示198个位点（40.4%）位于峰内，27个位点（5.5%）位于附近峰区域。Neat1、Igf1r和Synpo2l的代表性转录本显示位点-峰重叠。GLORI在人类DCM样本中验证了NEAT1对应区域m6A位点的存在。
联合转录组和表观转录组m6A分析显示心脏衰竭中异构体特异性m6A动态：DTU分析在30G与假手术小鼠间鉴定出416个事件。具有DTU事件和DMR位点的转录本在43个转录本处重叠，其中10个转录本与人类心脏样本差异富集峰转录本进一步交叉，包括Synpo2l。在假手术小鼠中isoform 1最丰富（63.56%），而在30G小鼠中isoform 3占主导（77.75%）。三种异构体在30G中均显著上调，但倍数变化差异显著：isoform 1增加1.5倍，isoform 2增加3.8倍，isoform 3增加18.4倍。在共享最后外显子中鉴定出11个平均m6A水平高于10%的位点。isoform 1始终具有最高m6A水平，isoform 3最低。Synpo2l在心脏衰竭中被归类为低甲基化转录本，并非由同一转录本内m6A丢失解释，而是由向固有携带较少修饰的转录本异构体转换所致。
差异启动子活性调控SYNPO2L异构体表达：在人类转录组中鉴定出相似的SYNPO2L异构体。在人类DCM心脏中，isoform 3 RNA表达显著上调，而isoform 1和2无变化。在hSC-CM中，ET-1处理后SYNPO2L isoform 2和3 RNA表达显著上调。荧光素酶报告基因实验显示isoform 1和2启动子活性超过400倍，350-nt和1,000-nt isoform 3构建体显示最小活性，而1,500-nt构建体显示约23.9倍活性。ET-1降低isoform 1启动子活性，增加1,500-nt构建体活性。DRE在基线时降低isoform 1启动子活性并增加isoform 2和3活性。
m6A修饰对SYNPO2L异构体调控的直接和间接效应：在hSC-CM中过表达m6A写入酶，isoform 3在METTL3和METTL14野生型条件下显著上调。心脏应激标志物NPPA、MYH7和ACTA1在METTL3 WT中也上调。2×2析因处理显示ET-1和STM2457分别上调isoform 2和3，ET-1效应更强。联合处理使isoform 1、2和3分别增加至未处理对照的约1.6倍、5.7倍和6.4倍。MeRIP-qPCR显示总SYNPO2L m6A富集在ET-1和STM2457处理后降低。放线菌素D实验显示STM2457处理显著延长isoform 2和3的半衰期，但不影响isoform 1。结果表明m6A写入酶过表达通过启动心脏应激信号间接触发特定SYNPO2L异构体转录，而m6A沉积直接靶向SYNPO2L异构体进行转录本清除。
讨论部分总结：本研究使用ONT DRS在压力超负荷心脏衰竭模型中以碱基和转录本异构体分辨率绘制了转录组全局m6A图谱。研究发现心脏衰竭中发生广泛且动态的m6A重塑，并揭示了转录本异构体特异性m6A差异的存在。DRACH上下文m6A模型优先考虑高置信度位点检测，以覆盖度换取准确性。DMR–DEG比较未发现全局相关性。基序富集在TAC模型间存在差异，AAACA在27G上调位点中富集，GGACR在30G中占主导，提示心脏衰竭不同阶段存在不同调控机制。跨物种比较揭示了小鼠和人类心脏衰竭间保守的m6A调控。异构体分辨DRS分析表明Synpo2l平均甲基化降低主要反映向携带较少修饰的转录本变体转换。研究存在若干局限性：未将单个酶与特定位点关联；人类和小鼠数据集使用不同平台生成；跨平台一致性超出本研究范围；27G测序质量欠佳限制了位点覆盖和异构体注释。研究结论翻译：总之，本研究提供了心脏衰竭中转录组全局、碱基分辨率的m6A图谱，鉴定了保守调控特征并揭示了异构体特异性m6A动态。这些发现拓展了对m6A调控的理解，为未来旨在鉴定心脏衰竭治疗性表观转录组靶点的研究提供了基础。
