《Psyche: A Journal of Entomology》：Comparative Genetic Analysis of Lesser-Studied Culicoides Latreille, 1809 (Diptera: Ceratopogonidae) Collected in Ireland and Related Populations Across Europe
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蠓（Culicoides）类吸血蠓为体外寄生虫，可作为动物与人类病原体的传播媒介。以往研究多集中于古北区当时归入Obsoletus组与Pulicaris组的重要家畜病原体传播媒介物种，而其他较少见的物种研究不足。本研究旨在阐明这一研究较少亚群的遗传多样性。研究
蠓（Culicoides）类吸血蠓为体外寄生虫，可作为动物与人类病原体的传播媒介。以往研究多集中于古北区当时归入Obsoletus组与Pulicaris组的重要家畜病原体传播媒介物种，而其他较少见的物种研究不足。本研究旨在阐明这一研究较少亚群的遗传多样性。研究人员于2022年6月至2023年12月在爱尔兰13个采样点使用Onderstepoort诱虫灯采集的133只蠓，依据翅形态鉴定为Culicoides achrayi、Culicoides fascipennis、Culicoides festivipennis、Culicoides kibunensis、Culicoides impunctatus、Culicoides nubeculosus、Culicoides pallidicornis、Culicoides pictipennis、Culicoides poperinghensis、Culicoides salinarius与Culicoides vexans。随后通过靶向线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因（COI）478 bp片段的PCR及Sanger测序确认鉴定结果。所得序列与GenBank记录比对，并与国际序列比对以构建系统发育树与网络，评估其遗传多样性及亲缘关系。总体上，93.5%的形态学鉴定经COI条形码确认。部分单倍型仅在爱尔兰记录，但其表观独特性可能反映数据库中已发表序列数量有限。总体而言，鲜有证据表明爱尔兰采集的蠓与欧洲大陆同类群在遗传上隔离，许多序列与其他地区发现的序列高度相似或完全一致。结果提示爱尔兰与欧洲大陆蠓种群之间存在频繁交流，强调持续监测的必要性。了解研究较少蠓类物种的遗传结构，有助于认识蠓种群动态与连通性，并为爱尔兰蠓传病原体的未来监测提供依据。
研究背景方面，蠓（Culicoides）类吸血蠓为体外寄生虫，已描述物种超过1300种，呈全球分布，是蠓科（Ceratopogonidae）体长1–5 mm的小型吸血蝇类。除对人类和动物造成显著滋扰外，部分研究较充分的蠓种，包括Culicoides imicola以及Obsoletus复合体与Pulicaris复合体物种，可传播具有兽医和公共卫生意义的病原体，如蓝舌病病毒（BTV）与施马伦贝格病毒（SBV），二者现已在欧洲多地呈地方性流行，且近年来欧洲多次报告流行性出血病病毒（EHDV）暴发。此外，尚有一些数量较少、研究不够深入的蠓种，其传播家畜病原体的能力多未检测，但部分物种如C. kibunensis与C. pictipennis已分别在唾液腺中发现禽类寄生虫Haemoproteus minutus与Haemoproteus parabelopolskyi的孢子体；在C. impunctatus、C. festivipennis与C. pallidicornis中也检测到血变形虫DNA；C. nubeculosus在实验条件下对Trypanosoma bennetti与Trypanosoma avium高度易感，其昆虫肠道内的寄生虫阶段可感染鸟类。多数蠓种可依据翅面色素图案进行形态鉴定，翅纹退化或高度相似的物种则需依据头部、口器、触角、复眼与生殖器形态区分，但此类形态鉴定属专家级任务。形态鉴定通常通过特定基因区域的PCR扩增与Sanger测序加以确认，最常靶向的DNA区域为线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因（COI）、核糖体内转录间隔区1和2（ITS1和ITS2）或唾液蛋白编码区。DNA条形码还可用于探讨种群动态与种群间系统发育关系，为地理扩散与新区域定殖提供重要信息。然而迄今多数已发表工作集中于已知媒介物种，GenBank数据库对C. obsoletus或C. imicola等常见物种的COI记录较为充分，而对C. achrayi或C. poperinghensis等较稀少物种的信息明显不足。因此，本研究旨在调查爱尔兰数种较少见蠓种的遗传多样性及其与欧洲大陆同种个体的系统发育关系。
研究人员开展了如下研究：在爱尔兰都柏林、米斯、莱伊什、科克、凯里、卡洛、戈尔韦、克莱尔、利默里克、梅奥、沃特福德与基尔肯尼等郡的13个采样点，以Onderstepoort兽医研究所型紫外光（UV）吸虫灯每两周操作一晚，持续18个月（2022年6月至2023年12月），采集样本于次日晨转移至70%（v/v）乙醇并常温保存。依据西古北区雌性蠓交互式鉴定检索表按翅纹进行形态鉴定；对每个已鉴定物种的代表性标本及形态隐存标本提取DNA，扩增COI位点478 bp片段并测序。序列质量以Chromas评估，剔除质量差或长度不足者，其余序列与GenBank比对，并在分子进化遗传学分析软件（MEGA，版本11.0.13）中以ClustalW工具与国际已发表序列比对。系统发育树采用邻接法（neighbour-joining）构建，以1000次自举重复（bootstrap）保证稳健性，并加入Isiye等近期发表的爱尔兰媒介物种序列作比较，按分类系统进行亚属颜色编码，树图在iTOL 7.2中排版。序列另以PopART（版本1.7）比较，构建整数邻接网络图（reticulation tolerance 0.5）。对每个物种计算单倍型数、分离位点数、单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（π）以及平均与最大未校正成对距离。最后以QGIS.org（版本3.30）绘制欧亚地图，展示纳入本研究的各国序列数量。研究结论为：COI基因区域片段序列分析显示，爱尔兰标本与来自大西洋边缘以及中欧和东欧的蠓在遗传上关系密切。爱尔兰与英国/大陆种群之间共享COI单倍型，与偶发的长距离风媒扩散相符，但尚无法确定其发生频率。了解蠓种群的地理动态，对监测和预测未来蠓传疾病暴发可能具有重要价值。
关键技术方法方面，研究采用Onderstepoort兽医研究所型紫外光吸虫灯在爱尔兰13个采样点进行为期18个月的野外采集，样本来源为2022年6月至2023年12月采集的蠓标本；以翅形态及西古北区雌性蠓交互式检索表完成形态鉴定；采用DNA提取、COI基因478 bp片段PCR扩增与Sanger测序进行分子鉴定；以MEGA 11.0.13中的ClustalW比对、邻接法建树及1000次自举检验开展系统发育分析；以PopART 1.7构建整数邻接网络并计算单倍型多样性、核苷酸多样性与成对距离；以QGIS 3.30绘制序列来源地图。
研究结果方面，3.1 标本鉴定：共鉴定出C. achrayi（西海岸1个采样点）、C. fascipennis（5个采样点，主要在西海岸）、C. festivipennis（全国8个采样点）、C. kibunensis（全国10个采样点）、C. impunctatus（8个采样点，主要在西北部诱虫点）、C. nubeculosus（全国6个采样点）、C. pallidicornis（东南部1个采样点）、C. pictipennis（西海岸3个采样点）、C. poperinghensis（南海岸1个采样点）、C. salinarius（北部与东部4个采样点）与C. vexans（西海岸1个采样点）。季节性上，C. chiopterus季节最长（3月至11月）；C. nubeculosus与C. kibunensis在5月至10月采集（6个月）；C. festivipennis在5月至9月采集；C. achrayi与C. fascipennis在6月至10月采集（5个月）；C. dewulfi与C. salinarius在6月至9月采集（4个月）；C. circumscriptus、C. impunctatus与C. pictipennis分别在6月至8月、5月至7月、4月至6月的3个月内采集；C. newsteadi（4月）、C. poperinghensis（5月）与C. vexans（5月）各仅采集1只；C. pallidicornis采集3只，均属6月同一次捕获。共对133只标本测序，仅检出2例误鉴定（均为C. salinarius被误鉴定为C. circumscriptus），总体成功率为93.5%；共获得62条高质量COI序列（GenBank登录号PX413112至PX413138），并与从GenBank检索的220条已发表序列比较。3.2 系统发育分析：基于478 bp COI基因片段的邻接树包含本研究鉴定物种序列及Isiye等发表的爱尔兰Obsoletus与Pulicaris复合体常见物种序列，100%相同序列仅显示一次；本研究所得C. pallidicornis序列低于可比对长度要求，以数据库参考序列（立陶宛）替代。树中代表7个亚属及1个不属于任何亚属的物种（unplaced）；Monoculicoides与Avaritia聚在一起，而Sensiculicoides、Culicoides与Silvaticulicoides亚属物种分散于树中；形态相似的C. pulicaris与C. punctatus未聚在一起，C. dewulfi较其他Obsoletus组物种更接近C. festivipennis。除C. kibunensis因遗传多样性过高无法生成有效网络而改用邻接系统发育树外，其余物种均构建整数邻接网络。3.2.1 C. achrayi（3条爱尔兰序列与8条国际序列，472 bp）：序列来自瑞典、德国、斯洛伐克与爱尔兰，多样性低（π=0.27%），网络有3个分支，爱尔兰序列均位于一个分支（2个单倍型仅相差1个突变），并显示2个未描述的理论单倍型（黑点），提示存在缺失单倍型；一个中心单倍型为瑞典、德国与斯洛伐克共有，其余仅出现一次。3.2.2 C. fascipennis（9条爱尔兰序列与12条国际序列，404 bp）：序列来自爱尔兰、瑞典、挪威、立陶宛、瑞士与俄罗斯，遗传多样性与C. achrayi相近（π=0.30%），一个由爱尔兰序列构成的分支包含本研究测序的全部9只标本（6条相同，3条相差单个核苷酸多态性[SNP]）。3.2.3 C. festivipennis（4条爱尔兰序列与27条国际序列，454 bp）：序列来自立陶宛、西班牙、瑞士、瑞典、斯洛伐克、土耳其与德国，遗传多样性高于前两种（π=0.64%），爱尔兰标本与欧洲大陆标本关系更近（本研究4条序列中3条与斯洛伐克和立陶宛标本100%一致）。3.2.4 C. impunctatus（1条爱尔兰序列与32条国际序列，457 bp）：纳入爱尔兰、英国、俄罗斯、挪威、丹麦、立陶宛与瑞典序列，网络呈星爆状，多样性中等（π=0.38%），唯一爱尔兰序列与2条英国序列100%一致。3.2.5 C. nubeculosus（17条爱尔兰序列与15条国际序列，427 bp）：爱尔兰序列多于其他5国（瑞典、法国、土耳其、斯洛伐克与立陶宛）之和，多样性低（π=0.25%），爱尔兰标本与其他已发表序列（尤其法国与瑞典）高度相似或一致，但也存在一个主要含爱尔兰序列的分支。3.2.6 C. pallidicornis（3条爱尔兰序列与26条国际序列，378 bp）：纳入爱尔兰、瑞典、斯洛伐克、立陶宛、瑞士、法国、挪威与德国序列，网络图与核苷酸多样性显示中等多样性（π=0.90%），具大型中心群及众多分支变异，爱尔兰序列未聚在一起而位于网络不同分支。3.2.7 C. pictipennis（3条爱尔兰序列与16条国际序列，429 bp）：序列来自爱尔兰、挪威、斯洛伐克、立陶宛、瑞典、德国与俄罗斯，网络图显示高多样性（π=1.27%），爱尔兰标本（加1条挪威序列）与其他序列至少相差8个SNP而明显分开。3.2.8 C. poperinghensis（1条爱尔兰序列与6条国际序列，543 bp）：数据库仅爱尔兰、西班牙、瑞典与德国4国序列，爱尔兰仅1条，网络图显示低多样性（π=0.12%），爱尔兰序列位于距中心群最远处。3.2.9 C. salinarius（9条爱尔兰序列与13条国际序列，454 bp）：纳入爱尔兰、斯洛伐克、瑞典、挪威、立陶宛与德国序列，网络图与核苷酸多样性显示中等多样性（π=0.93%），但爱尔兰标本彼此100%一致，并与斯洛伐克和瑞典的2条标本100%一致。3.2.10 C. vexans（1条爱尔兰序列与22条国际序列，435 bp）：仅爱尔兰、法国与瑞典3国序列可用，网络与核苷酸多样性显示很高遗传多样性（π=4.18%）。3.2.11 C. kibunensis（16条爱尔兰序列与43条国际序列，418 bp）：来自爱尔兰、中国、日本、西班牙、挪威、立陶宛、斯洛伐克、瑞典与罗马尼亚9国序列的系统发育分析同样显示很高遗传多样性（π=4.89%），单倍型在地理上广泛分散；多数爱尔兰序列聚于一个分支，另有3条分别与挪威/立陶宛、罗马尼亚及瑞典/斯洛伐克标本聚在一起。C. vexans与C. kibunensis的成对距离分布呈明显双峰且无中间值：C. vexans的253次成对比较中67次低于1%、186次超过3%，无1%–3%之间者；C. kibunensis的78次比较中48次低于1%、30次超过4%，无1%–4%之间者。爱尔兰来源的C. kibunensis序列分为两组，组间差异5.02%–5.50%，组内一致度为0.48%–0.96%；C. kibunensis共获36个单倍型，其中8个包含爱尔兰序列，6个仅在爱尔兰记录。综上，C. achrayi、C. fascipennis、C. pictipennis与C. salinarius等物种的爱尔兰序列在网络中聚于单一分支，而C. festivipennis、C. kibunensis、C. nubeculosus与C. pallidicornis等物种的爱尔兰序列与欧洲大陆标本更交错分布且匹配更紧密。为避免贡献序列较多的国家带来偏倚，研究人员对网络分析纳入的COI序列数进行了地图展示，多数比较序列来自瑞典，其次为立陶宛、法国与斯洛伐克。
讨论部分总结：通常设置于农田附近牲畜周边或畜舍内的Onderstepoort诱虫灯监测中，欧洲约80%–90%的吸血蠓为Obsoletus组与Pulicaris组的已知媒介物种；本研究聚焦占总捕获量其余10%–20%、研究远为不足且对BTV和SBV等重要家畜病原体媒介地位尚未确定的物种，即使其中部分具媒介能力，其在牲畜附近的相对丰度可能过低而难以显著贡献传播，但在其他非农田生境中其可能占蠓种群的更大比例，并作为某些禽类病原体的媒介在流行病学中发挥作用。基于COI序列的系统发育树显示，这些较少见物种散布于已确立的媒介物种之间，并未形成独立分支；COI位点不提供媒介能力的遗传信息，仅作为条形码位点与系统发育关系标记，因此其提示较稀有物种并不构成区别于已知媒介的独立谱系，其是否对BTV或SBV具媒介能力只能通过实验感染研究确定。值得注意的是，爱尔兰物种的系统发育树与目前主要基于形态特征的属分类并不完全吻合，如形态高度相似的C. pulicaris与C. punctatus被分开，而C. dewulfi与C. festivipennis聚近；此类不一致与呼吁结合形态和遗传信息建立新分类的主张相符，但基于单一且相对较短的线粒体标记，解析种间关系的能力有限，更稳健的解析需多基因座信息乃至全基因组数据。对研究较少蠓种的系统发育分析可提供该属及其种群动态的有价值信息，例如C. impunctatus网络中的星爆效应可能提示单倍型仍从主要/常见中心单倍型演化，而C. vexans与C. kibunensis系统发育中的高度异质性对其分类地位提出疑问，即二者是否为物种复合体而非单一物种；两者成对距离均呈双峰且无中间值，可能提示同一名称下存在一个以上谱系；C. kibunensis两组差异约5%，但实际采自米斯郡同一位点，表明该模式并非地理隔离所致；但须强调该分析基于单一線粒体标记，且部分较大距离可能反映数据库错误，需针对C. kibunensis多个基因座进一步基因分型以确定其是否实际包含两个物种；对C. vexans而言此点已确立，西欧Vexans组（Oecata亚属）包括近缘种C. vexans、C. brunnicans与C. santonicus，主要依翅纹区分，且仅通过整合形态与分子方法可靠分离。爱尔兰与欧洲大陆蠓的系统发育比较亦可用于评估两区域种群交流频率：多数序列落入主要由爱尔兰序列构成的簇，提示一定程度的地理种群结构，但许多爱尔兰标本与其他国家标本COI序列高度同源；已知蠓可随风长距离迁移，爱尔兰、英国与欧洲大陆之间偶发迁移可致遗传关系密切，事实上2012年SBV最可能由英国随风长距离传入爱尔兰的感染蠓引入；本研究多数爱尔兰序列与来自大西洋边缘（挪威、英国、瑞典、法国与西班牙）的序列一致，支持该假说，同时亦有若干爱尔兰COI序列与中欧和东欧（瑞士、斯洛伐克与立陶宛）标本高度一致，提示蠓的迁移可能比通常认为的更远更频繁；Isiye等亦报告爱尔兰许多C. obsoletus s. s. COI单倍型与英国及欧洲大陆常见单倍型相似。然而，需更多来自其他地理区域的序列以认识蠓在大陆块间及欧洲与其他区域间迁移的距离与频率，及其促进蠓传病原体扩散的潜在作用；此外，数据库多数序列来自欧洲少数国家且为机会性采样，很可能遗漏许多单倍型，故看似爱尔兰独有的单倍型可能仅因其他地区采样不足；随着更多且分布更均匀的序列出现，部分表观地理结构也可能消失。结论部分译文：COI基因区域片段序列分析显示，爱尔兰标本与来自大西洋边缘以及中欧和东欧的蠓在遗传上关系密切。爱尔兰与英国/大陆种群之间共享COI单倍型，与偶发的长距离风媒扩散相符，但尚无法确定其发生频率。了解蠓种群的地理动态，对监测和预测未来蠓传疾病暴发可能具有重要价值。
