《Scientifica》：Bioactive Spirulina Protein Hydrolysate Mitigates Cyclophosphamide-Induced Physiological, Biochemical, Histopathological, and Oxidative Stress Alterations in Rats
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化疗诱导的毒性仍然是癌症治疗中的重大挑战；天然产物来源的膳食补充剂作为潜在保护剂已引起广泛关注。螺旋藻是一种营养丰富的丝状蓝细菌，广泛用作膳食补充剂，因其抗氧化和抗炎特性而受到认可。本研究评估了螺旋藻蛋白水解物（SPH）对环磷酰胺（CP）诱导的雄性Wistar
化疗诱导的毒性仍然是癌症治疗中的重大挑战；天然产物来源的膳食补充剂作为潜在保护剂已引起广泛关注。螺旋藻是一种营养丰富的丝状蓝细菌，广泛用作膳食补充剂，因其抗氧化和抗炎特性而受到认可。本研究评估了螺旋藻蛋白水解物（SPH）对环磷酰胺（CP）诱导的雄性Wistar大鼠全身毒性的保护作用，大鼠到达时8周龄。适应1周后，大鼠被分配至四组（n = 6/组）：正常对照组（NC）、环磷酰胺对照组（CP）及两个水解物处理组。水解物以3或6 mg/kg体重每日口服给药，持续14天，环磷酰胺（200 mg/kg体重）于第7天和第14天腹腔注射。组织病理学检查采用苏木精-伊红（H&E）染色。环磷酰胺暴露与较低的体重和精子活力相关，而水解物处理组大鼠体重持续增加，精子活力高于环磷酰胺对照组（p < 0.05）。水解物补充使部分血清生化参数向正常对照值方向转变。血清白蛋白（ALB）浓度在环磷酰胺对照组为2.52 ± 0.18 g/dL，在3和6 mg/kg水解物组分别为3.62 ± 0.23和3.63 ± 0.37 g/dL（均值 ± 标准差；与环磷酰胺对照组相比均p < 0.05）。组织病理学检查显示环磷酰胺相关的肝脏、肾脏、肺、睾丸、附睾、精囊和前列腺损伤。水解物处理组，尤其是高剂量组，表现出更好的组织架构保存和更少的炎症及退行性改变。这些发现表明螺旋藻蛋白水解物可能缓解环磷酰胺相关的部分生理、生化和组织病理学改变，为其作为支持性膳食干预的潜力提供了初步的临床前证据。
**研究背景与问题**
化疗药物环磷酰胺（CP）虽广泛用于卵巢腺癌、乳腺腺癌、小细胞肺癌、胰腺导管腺癌及神经母细胞瘤的治疗，但其通过肝细胞色素P450介导活化后产生的丙烯醛（acrolein）等活性代谢产物可引发活性氧（ROS）过度生成、线粒体功能障碍及细胞氧化还原稳态紊乱，进而导致肝脏、肾脏、肺、心脏、睾丸及生殖组织等多器官毒性。天然产物来源的膳食补充剂作为化疗不良反应的缓解手段已引起广泛关注。螺旋藻（Spirulina）作为一种营养丰富的丝状蓝细菌，因其抗氧化和抗炎特性而被认可。然而，既往研究多采用全螺旋藻粉，且聚焦于睾丸损伤，尚未明确酶解制备的蛋白水解物（SPH）是否能影响CP相关的多器官及多系统改变。基于此，研究人员提出假设：口服SPH可减轻雄性Wistar大鼠中CP相关的生理、生殖、生化、氧化应激及组织病理学改变，并对此进行了系统评估。
**研究内容与结论**
研究人员以8周龄雄性Wistar大鼠为对象，设置正常对照（NC）、CP对照、SPH3（3 mg/kg BW）和SPH6（6 mg/kg BW）四组（n = 6/组）。SPH每日口服一次持续14天，CP（200 mg/kg BW）于第7天和第14天腹腔注射。结果表明，SPH处理组体重持续增加且精子活力显著高于CP组；部分血清生化指标向正常值回归；组织病理学显示SPH处理组（尤其高剂量组）在多器官中组织架构保存更好、炎症和退行性改变更少。研究结论为：SPH给药与CP暴露大鼠部分生理、生殖、血清生化、抗氧化及组织病理学参数的有利变化相关，但各参数响应不一致，组织病理学评估为定性性质。这些发现为SPH作为支持性膳食干预的潜力提供了初步临床前证据，尚需进一步研究表征生物活性肽成分、阐明机制并开展定量组织评估。
**主要关键技术方法**
研究采用甲醇预处理去除叶绿素的干燥螺旋藻生物质，经Viscozyme酶解联合超声辅助提取蛋白（得率约37.50% w/w），再以Alcalase在超声辅助下按响应面法（中心复合设计）优化条件（pH 6.93、58.03°C、56.94 min、酶/蛋白比4.48% w/w）进行水解，酶于90°C灭活20 min后离心、冻干。动物实验采用8周龄雄性Wistar大鼠（250–300 g，泰国Nomura Siam International Co., Ltd.），经1周适应后按基线体重分层随机分组。检测指标包括体重、摄食摄水量、相对器官重量、精子质量（形态、浓度、活力、活力）、血清生化（23项兽医通用生化面板）、血清氧化应激标志物（MDA、GSH、SOD、CAT、GPx、GR、GST）及多组织H&E染色组织病理学检查。统计分析采用PAST 4.03和R 4.6.1，根据数据分布分别采用单因素方差分析（ANOVA）配合Tukey检验、Welch ANOVA配合Games–Howell检验或Kruskal–Wallis检验配合Dunn检验。
**研究结果**
**3.1 SPH对CP诱导大鼠生理参数的影响**
3.1.1 体重与摄食摄水量：第1天各组体重无显著差异（Kruskal–Wallis检验，p = 0.206），第7天出现显著差异（p = 0.009），第14天差异显著（单因素ANOVA，p < 0.001）。CP组体重显著低于NC、SPH6和SPH3组，两个SPH组间无显著差异。第14天平均体重分别为NC 386.67 ± 6.06 g、CP 260.83 ± 17.44 g、SPH6 334.17 ± 15.30 g、SPH3 348.33 ± 27.33 g。摄食量在各时间点组间无显著差异（p > 0.05），但CP组第7天和第14天均值数值上较低。第14天饮水量组间差异显著（Kruskal–Wallis检验，p = 0.039），CP组均值最低（16.67 ± 3.06 mL/笼）。
3.1.2 相对器官重量：相对肝脏重量组间无显著差异（p = 0.384）。相对肾脏重量差异显著（p < 0.001），CP组显著高于NC组。相对肺重量差异显著（p < 0.001），CP组显著高于NC、SPH3和SPH6组，SPH6组亦显著高于NC组。心脏相对重量组间差异显著（p = 0.012），SPH3组显著高于NC组。生殖器官方面，相对睾丸重量差异显著（单因素ANOVA，p < 0.001），CP组显著高于NC（p < 0.001）、SPH6（p = 0.035）和SPH3（p = 0.005）组，SPH6和SPH3组与NC组无显著差异。相对附睾重量差异显著（Kruskal–Wallis检验，p = 0.022），Dunn事后检验显示CP与NC组间差异显著（p = 0.002），其余两两比较无显著差异。相对前列腺和精囊重量组间无显著差异（p = 0.459和p = 0.238）。
**3.2 精子质量评估**
3.2.1 精子形态：正常精子形态为弯曲头部和单一未卷曲尾部。各组形态正常精子比例分别为NC 64.13%、CP 56.83%、SPH6 59.75%、SPH3 57.50%。尾部异常为主要形态异常，分别占35.25%、41.33%、39.38%和41.88%。头部异常分别占0.63%、1.83%、0.63%和0.38%，头尾联合异常分别占0%、0%、0.25%和0.25%。
3.2.2 精子浓度：各组间无显著差异。
3.2.3 精子活力：CP组显著低于NC组；SPH6和SPH3组显著高于CP组，与NC组相当。
3.2.4 精子运动力：NC组前向运动力最高、不动精子比例最低；CP组前向运动力低于NC组、不动精子比例高于NC组；SPH6组前向运动力高于CP组但仍低于NC组；SPH3组前向运动力与CP组相当，不动精子比例高于NC组。环形运动在所有组中均较低。
**3.3 生化分析**
3.3.1 血清生化参数：与NC组相比，CP组ALB、ALB/GLB、CO2、AMY和CK显著降低，ALP、AST、TBA、BUN和尿素/肌酐比显著升高（p < 0.05）。TP、ALT、AST/ALT、CRE、TCH、GGT、DBIL、TBIL、GLOB、IBIL、Ca和GLU在CP与NC组间无显著差异。与CP组相比，SPH6和SPH3组ALB、TP、ALB/GLB、CO2、AMY和CK显著升高，ALP、ALT、AST和TBA显著降低（p < 0.05）。AST/ALT比在SPH6组显著低于CP组，SPH3与CP组无显著差异。BUN仅在SPH3组显著低于CP组。两个SPH组CRE和尿素/肌酐比与CP组无显著差异。TCH在两个SPH组均显著高于CP和NC组。
3.3.2 血清氧化应激标志物：MDA浓度组间无显著差异（Kruskal–Wallis检验，p > 0.05）。SOD活性组间差异显著（Welch ANOVA，p < 0.001），SPH6和SPH3组显著低于NC组，CP组与NC或SPH3组无显著差异，SPH3组显著低于其他各组（p < 0.05）。CAT活性组间差异显著（单因素ANOVA，p < 0.05），SPH6组显著高于CP和SPH3组，SPH6与NC组无显著差异。GPx活性组间差异显著（单因素ANOVA，p < 0.001），CP组显著低于NC、SPH6和SPH3组，NC与SPH处理组间无显著差异。GSH浓度组间无显著差异（p > 0.05）。GR活性组间差异显著（单因素ANOVA，p < 0.001），CP组显著低于所有其他组；SPH6组显著高于CP组但显著低于NC和SPH3组；SPH3与NC组无显著差异。GST活性组间无显著差异（p > 0.05）。
**3.4 SPH对CP诱导大鼠组织病理学改变的影响**
肝脏：NC组肝架构保存完好，肝细胞排列整齐，可见肝窦、Kupffer细胞及完整血管和门管结构。CP组显示肝细胞坏死及正常肝组织破坏。SPH处理组（SPH6和SPH3） representative切片显示肝细胞组织和肝窦总体保存。
肾脏：NC组肾架构典型，肾小球、Bowman囊、近曲小管和远曲小管保存完好。CP组显示肾小管扩张、肾小球皱缩及炎性细胞浸润。SPH6组肾小球、Bowman囊和肾小管定义更清晰；SPH3组肾形态总体保存，但肾小管改变和炎性细胞浸润仍可观察到。
心脏：所有组心肌架构相对保存，心肌细胞排列规则、核可见。CP组与NC组相比未见明显心肌坏死、炎性细胞浸润或心脏纤维显著破坏。SPH6和SPH3组亦未见明显形态学改变。
肺：NC组肺架构正常，可见细支气管、开放的肺泡腔、肺泡管、肺泡细胞和肺泡巨噬细胞。CP组显示肺泡间隔增厚和间质炎性细胞浸润。SPH6组肺泡腔相对更开放、间质炎性细胞浸润较CP组不明显；SPH3组肺泡间隔增厚和炎性细胞浸润仍可观察到。
睾丸：NC组生精小管架构正常，生精细胞层排列有序，管腔内可见精原细胞、初级精母细胞、精子细胞和精子。CP组显示明显睾丸损伤，特征为生精小管组织破坏、生殖细胞脱落到管腔、空泡化及多核巨细胞。SPH6组生精细胞层更有组织、生殖细胞变性较不明显；SPH3组生精小管架构相对保存，但生殖细胞脱落仍可观察到。
附睾：NC组附睾架构正常，附睾上皮完整、间质结构正常、管腔内精子丰富。CP组显示透明细胞增生、管腔内精子减少、生殖细胞脱落及管腔精子密度明显较低的区域。SPH6组附睾上皮相对完整、管腔内精子含量较CP组更多；SPH3组附睾架构相对保存，但上皮改变和透明细胞增生仍可观察到。
精囊：NC组组织架构正常，精囊上皮完整、管腔内有精囊分泌液。CP组显示上皮改变，主要为精囊上皮空泡化。SPH处理组精囊上皮相对更保存，但SPH3和SPH6组均仍可观察到轻度上皮空泡化。
前列腺：NC组前列腺架构典型，前列腺上皮完整、间质结构正常、腺腔内有前列腺液。CP组显示上皮空泡化、白细胞浸润、凋亡样细胞及腺腔内脱落细胞碎片。SPH6组前列腺上皮结构相对保存，但上皮空泡化仍可观察到；SPH3组前列腺架构亦相对保存，但炎性细胞和脱落细胞碎片仍可观察到。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CP处理大鼠实验末期体重显著降低，而SPH处理组体重高于CP组，两个SPH组体重均持续增加但最终仍低于NC组。摄食量组间无显著差异。相对器官重量在各器官间无一致模式，相对睾丸和附睾重量的变化应结合最终体重、精子质量和组织病理学发现解读。生殖改变方面，相对睾丸和附睾重量组间有差异，而前列腺和精囊相对重量无显著差异；精子浓度组间无显著差异；精子活力CP组显著低于NC组，两个SPH组显著高于CP组且与NC组相当；精子运动力响应模式不同，SPH6组前向运动力高于CP组但仍低于NC组，SPH3组与CP组相当。这些发现表明SPH相关的生殖响应具有终点特异性。血清生化方面，CP暴露与部分肝脏、酸碱平衡和代谢参数显著改变相关而非整个生化谱的统一变化；SPH给药与肝脏功能和蛋白状态相关的部分血清参数有利变化相关，但不应解释为肝功能完全恢复的证据。肾脏和代谢相关发现更为异质：CP组CO2显著低于NC组，两个SPH组显著高于CP组；BUN仅在SPH3组显著低于CP组，CRE在SPH处理组与CP组间无显著差异，尿素/肌酐比仍显著高于NC组，因此不支持肾功能普遍恢复的结论；TCH在两个SPH组显著高于CP和NC组，表明并非所有SPH相关的生化变化均向对照值方向转变。CP组AMY和CK活性显著低于NC组，两个SPH组显著高于CP组且与NC组统计相当，但这些酶应谨慎解读，因总血清AMY非胰腺特异性、总CK不区分组织特异性同工酶。血清氧化应激结果显示生物标志物特异性响应而非抗氧化状态的统一改善：GPx活性CP组显著低于NC组，两个SPH组显著高于CP组；GR活性CP组显著低于NC组，两个SPH组高于CP组但剂量间响应不同（SPH3组与NC组相当，SPH6组仍显著低于NC组）；CAT活性SPH6组高于CP和SPH3组且与NC组无显著差异；MDA、GSH和GST组间无显著差异；SOD活性SPH6和SPH3组显著低于NC组，CP组与NC或SPH6组无显著差异。这些结果共同表明SPH效应在抗氧化和氧化应激标志物间不一致，不支持普遍抗氧化效应；主要治疗相关变化见于GPx、GR及高剂量SPH的CAT活性。组织病理学检查显示CP给药后多组织形态学改变，SPH处理组 representative切片在肝脏、肾脏、肺、睾丸、附睾、精囊和前列腺等多个器官中总体显示更保存的组织架构，但组织病理学评估为定性且缺乏盲法病变评分或定量形态学分析，也未评估器官特异性氧化应激、炎症和凋亡标志物。结论部分译为：总之，CP给药与雄性Wistar大鼠部分生理、生殖、血清生化、抗氧化及组织病理学参数改变相关。SPH给药与其中若干终点的有利变化相关，包括较高的精子活力、部分精子运动力参数的改变、部分血清生化指标的正常化、特定抗氧化酶活性的升高以及 representative组织切片中相对保存的组织架构。然而，各测量参数的响应并不一致，组织病理学发现基于定性评估。这些发现提供了初步临床前证据表明SPH可能调节大鼠中CP暴露相关的部分改变。需要进一步研究表征生物活性肽成分、阐明潜在机制、纳入定量组织评估和器官特异性生物标志物，并在确立SPH作为支持性膳食干预的潜力之前评估这些发现的转化相关性。
