《Neurotherapeutics》：Dinotefuran aggravates Alzheimer's disease-associated microglial inflammation through the CHUK/NFKB1-mediated NF-κB signaling pathway
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新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid pesticides）是广泛使用的系统性杀虫剂，其神经毒性证据日益增多。然而，它们对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）相关神经炎症的潜在贡献仍知之甚少。本研究整合理化性质表征、靶点预测、通路
新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid pesticides）是广泛使用的系统性杀虫剂，其神经毒性证据日益增多。然而，它们对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）相关神经炎症的潜在贡献仍知之甚少。本研究整合理化性质表征、靶点预测、通路富集分析、人类AD单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、分子对接、分子动力学模拟及实验验证，系统评估了七种代表性新烟碱类杀虫剂。在七种化合物中，呋虫胺（dinotefuran）因其良好的血脑屏障（BBB）通透性和炎症相关通路富集而被优先筛选。将靶点预测与AD转录组分析相结合，研究人员鉴定出CHUK和NFKB1为与NF-κB信号通路相关的关键候选靶点。snRNA-seq分析进一步表明，AD大脑中小胶质细胞的NF-κB信号活性呈优先富集。分子对接和分子动力学模拟支持呋虫胺与IKKα（CHUK）及NF-κB1（p50）之间存在潜在相互作用。在Aβ处理的BV2小胶质细胞中，呋虫胺进一步增强CHUK/NFKB1介导的NF-κB信号通路激活，伴随IKKα表达增加、IκBα和p65磷酸化水平升高、NF-κB1激活增强，以及IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-α和IFN-β分泌增加。这些促炎效应可被NF-κB抑制剂BAY11-7082显著减弱。综上，研究结果表明CHUK/NFKB1相关的NF-κB信号通路可能参与呋虫胺增强Aβ处理的BV2小胶质细胞炎症反应的过程，为新烟碱类杀虫剂可能参与AD相关神经炎症提供了初步机制见解。
论文解读
一、研究背景与科学问题
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，以进行性认知衰退、突触功能障碍、神经元丢失和慢性神经炎症为主要特征。尽管衰老是AD最强的风险因素，但越来越多的证据表明环境暴露对疾病的发生和进展也有重要贡献。在环境毒物中，农药暴露因其与神经退行性疾病的潜在关联而受到广泛关注。既往研究主要集中于有机磷类和有机氯类农药，而新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid pesticides）对AD相关病理过程的潜在贡献仍相对缺乏探索。
新烟碱类杀虫剂是一类结构类似尼古丁的合成杀虫剂，主要通过靶向昆虫神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）发挥杀虫作用。由于高效杀虫活性和相对广谱的抗虫活性，它们已成为现代农业中应用最广泛的内吸性杀虫剂之一。常见的新烟碱类化合物包括吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、啶虫脒和呋虫胺等，在全球范围内广泛用于作物保护、种子处理和害虫管理。由于其广泛使用和环境持久性，新烟碱类已成为普遍存在的环境污染物，可在土壤、地表水、食品和人体生物样本中检出。
越来越多的证据表明，新烟碱类的毒理学效应不仅限于昆虫，还可能影响哺乳动物生理系统，尤其是神经系统。实验研究已证明新烟碱暴露可诱导氧化应激、神经炎症反应、突触功能障碍和行为异常。值得注意的是，新烟碱类作用于与突触传递和认知功能密切相关的烟碱型乙酰胆碱受体，而胆碱能信号失调长期以来被认为与AD发病机制有关。然而，哪些新烟碱类化合物与AD相关生物学通路关联最强，以及它们是否参与AD大脑中的神经炎症信号，仍不清楚。
神经炎症日益被认为是AD进展的核心贡献因素，小胶质细胞是中枢神经系统中主要的免疫效应细胞。在病理条件下，活化的小胶质细胞可产生促炎细胞因子、活性氧和炎症小体相关介质，从而促进突触损伤和神经元损伤。在关键炎症通路中，NF-κB信号在调节小胶质细胞活化和炎症基因表达中发挥核心作用。NF-κB信号的异常激活已被广泛涉及AD相关神经炎症。因此，探索新烟碱类杀虫剂是否与小胶质细胞介导的NF-κB信号相关，可能为它们对AD相关神经炎症过程的潜在贡献提供机制见解。
二、研究内容与主要结论
本研究采用整合策略，结合理化性质表征、血脑屏障通透性预测、靶点通路分析、单核转录组分析、分子对接、分子动力学模拟和实验验证，系统研究了新烟碱类杀虫剂与AD相关神经炎症之间的潜在关联。研究优先筛选出呋虫胺作为与AD相关炎症信号相关的代表性新烟碱类化合物。单核转录组分析证明NF-κB信号在AD大脑小胶质细胞中优先激活。此外，CHUK和NFKB1被鉴定为连接呋虫胺相关信号与AD小胶质细胞炎症反应的潜在NF-κB相关靶点，结构和实验分析进一步支持呋虫胺参与NF-κB介导的炎症激活。该研究为理解环境相关新烟碱类农药对AD相关神经炎症过程的潜在贡献提供了机制见解，拓展了新烟碱神经毒性研究超越传统神经行为或氧化应激相关效应的认知边界。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了多层次的整合分析框架。首先，从PubChem数据库获取七种新烟碱类杀虫剂（啶虫脒、噻虫胺、呋虫胺、吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫嗪、噻虫啉）的化学结构，使用SwissADME计算关键理化参数并预测血脑屏障通透性。其次，利用TargetNet数据库预测化合物相关靶基因，结合GeneCards数据库的AD相关基因相关性评分进行靶点-疾病关联分析，并使用clusterProfiler R包进行GO和KEGG富集分析。第三，从GEO数据库（GSE188545）下载人类颞中回单核RNA测序数据（含6例健康对照和6例AD样本），使用Seurat R包进行质量控制、标准化、降维聚类和细胞类型注释，并采用irGSEA R包结合AUCell、UCell、singscore和ssGSEA四种算法进行通路活性评分，通过Robust Rank Aggregation（RRA）整合获得共识通路富集排名。第四，使用Schr?dinger软件包进行分子对接（Glide超精密模式）和150 ns分子动力学模拟（Desmond模块），评估呋虫胺与IKKα和NF-κB p50的结合稳定性。最后，在BV2小胶质细胞中进行CCK-8细胞活力测定、Western blot、免疫荧光染色和ELISA实验验证。
四、研究结果
1. 血脑屏障通透性预测与理化表征
通过SwissADME计算七种新烟碱类杀虫剂的多种理化参数，包括分子量（MW）、氢键受体（HBA）、氢键供体（HBD）、偶极矩、溶剂可及表面积（SASA）、疏水表面积分数（FOSA）、极性表面积分数（FISA）和极性表面积（PISA），并生成雷达图进行可视化比较。QPlogBB评分显示噻虫胺、吡虫啉、呋虫胺和烯啶虫胺具有相对较高的预测血脑屏障通透性，而啶虫脒、噻虫嗪和噻虫啉的BBB穿透潜力相对较低。这表明多种新烟碱类农药可能具有穿透BBB并对中枢神经系统产生效应的潜力。
2. 整合靶点预测将呋虫胺优先鉴定为与炎症信号相关的AD关联新烟碱类化合物
从TargetNet数据库获取七种新烟碱类化合物的预测靶基因，UpSet图显示化合物间存在共享和特异性的靶点分布。KEGG富集分析显示富集通路包括AD、多疾病神经退行通路和脊髓小脑共济失调等神经退行相关通路。基于GeneCards数据库计算AD相关相关性评分，呋虫胺表现出最高的总相关性评分。功能富集分析进一步显示呋虫胺相关靶点主要富集于炎症相关生物学过程和NF-κB相关信号通路，KEGG通路富集分析突出显示了NF-κB信号、PI3K-Akt信号、mTOR信号、AMPK信号、钙信号、FoxO信号、鞘脂信号和HIF-1信号等多条炎症和应激相关通路。
3. 单核转录组学揭示AD大脑小胶质细胞中NF-κB信号优先激活
基于人类AD大脑单核转录组数据，鉴定出星形胶质细胞（ASC）、小胶质细胞（MG）、神经元（NEU）、少突胶质细胞（ODC）、少突胶质前体细胞（OPC）和血管细胞（VC）六种主要脑细胞群。通过四种通路评分算法和RRA整合分析，AD中多个脑细胞群存在广泛的免疫和炎症相关信号通路改变。多算法通路评分一致显示，与其他主要脑细胞群相比，小胶质细胞中NF-κB信号活性最为显著。密度分布和小提琴图分析进一步显示小胶质细胞中通路活性评分明显右移和升高，支持NF-κB相关炎症信号在该细胞群中的优先激活。
4. CHUK和NFKB1被鉴定为呋虫胺相关的核心NF-κB/AD靶点
对小胶质细胞进行AD与HC样本间的差异表达分析，火山图和热图显示AD小胶质细胞存在广泛的转录改变。KEGG和GO富集分析均显示炎症反应、免疫信号调节和NF-κB相关通路的显著富集。将呋虫胺预测靶基因、NF-κB通路相关基因和AD小胶质细胞差异表达基因三组基因集取交集，鉴定出CHUK和NFKB1为共享基因。CHUK编码IKKα，是参与NF-κB通路激活的关键上游激酶；NFKB1编码NF-κB转录因子复合物的p50亚基。点图分析显示CHUK和NFKB1在AD样本的小胶质细胞中表达均高于HC样本。
5. 分子对接和动力学模拟支持呋虫胺与CHUK/NFKB1相关蛋白的潜在相互作用
分子对接结果显示呋虫胺可 accommodated 在IKKα和NF-κB p50两者的结合口袋内，并与周围氨基酸残基形成多个氢键相互作用。150 ns分子动力学模拟的RMSD分析显示两个复合物在初始平衡阶段后达到相对稳定的构象状态。RMSF分析显示大多数氨基酸残基波动幅度较低。回旋半径（Rg）分析显示两个蛋白-配体复合物在模拟过程中保持相对稳定的结构紧凑性。氢键分析显示呋虫胺与两个靶蛋白之间存在持续的分子间氢键相互作用，进一步支持这些相互作用的稳定性。
6. 呋虫胺通过激活CHUK/NFKB1–NF-κB信号通路加剧Aβ诱导的小胶质细胞炎症
CCK-8实验显示呋虫胺呈剂量依赖性细胞毒性，100 μM被选为后续实验的亚细胞毒性浓度。Western blot分析显示，与单独Aβ处理相比，Aβ与呋虫胺共处理进一步增强了NF-κB信号激活，表现为p-IκBα/IκBα和p-p65/p65比值显著升高，IKKα、p105和p50表达呈上升趋势。这些改变可被NF-κB抑制剂BAY11-7082显著减弱。免疫荧光染色显示Aβ与呋虫胺共处理后BV2小胶质细胞中NF-κB1荧光强度显著增加，而BAY11-7082有效抑制NF-κB1激活。ELISA分析显示，与单独Aβ处理相比，Aβ与呋虫胺共处理显著增加了BV2细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-α和IFN-β的浓度，这些增加同样被BAY11-7082显著减弱。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，新烟碱类杀虫剂因其广泛的人体暴露和对中枢神经系统的潜在影响，正日益被认为是新兴环境神经毒物。既往研究多聚焦于传统农药类别，而新烟碱类在AD相关病理过程中的贡献尚未充分表征。本研究通过整合暴露组学分析、靶点通路分析、单核转录组学、结构建模和实验验证，将研究范围拓展至神经炎症信号层面。研究强调了在AD相关神经炎症研究中考虑环境相关农药暴露的重要性，为环境毒物如何影响神经退行性疾病相关炎症过程提供了新见解。
研究同时承认了若干局限性：功能验证仅在BV2小胶质细胞中进行，缺乏体内确认；下游机制研究仅聚焦于呋虫胺，其他新烟碱类化合物是否具有类似促炎效应尚不清楚；分子对接和动力学模拟仅预测了潜在相互作用，缺乏直接生化结合确认；100 μM的实验浓度超过典型人体环境暴露水平，未来需采用环境相关浓度和慢性低剂量暴露模型进一步验证。
研究结论为：呋虫胺可增强Aβ处理的BV2小胶质细胞中的炎症反应，这些效应伴随CHUK/NFKB1相关NF-κB信号通路的激活。CHUK/NFKB1相关的NF-κB信号可能参与呋虫胺增强Aβ处理的BV2小胶质细胞炎症反应的过程，为新烟碱类杀虫剂可能参与AD相关神经炎症提供了初步机制见解，但其对AD相关神经炎症的体内效应仍有待进一步确立。
