《Non-coding RNA Research》：A tRNACys-aptamer chimera co-targeting ADAMTS5 and
Ptgs2 interrupts the ECM-pyroptosis feedback loop in osteoarthritis
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骨关节炎（OA）由细胞外基质（ECM）破坏与炎症性细胞死亡的自我放大循环驱动，但目前仍缺乏疾病修饰疗法。本研究通过将人源化tRNACys反密码子茎环支架与ADAMTS5适配体融合，构建了一种多功能RNA嵌合体（CA5），从而在单一RNA分
骨关节炎（OA）由细胞外基质（ECM）破坏与炎症性细胞死亡的自我放大循环驱动，但目前仍缺乏疾病修饰疗法。本研究通过将人源化tRNACys反密码子茎环支架与ADAMTS5适配体融合，构建了一种多功能RNA嵌合体（CA5），从而在单一RNA分子中整合蛋白酶抑制与小RNA样转录后调控功能。在IL-1β刺激的软骨细胞中，CA5减轻聚集蛋白聚糖和胶原降解，抑制炎症介质，并强烈抑制焦亡，tRNACys支架与适配体结构域之间表现出显著协同效应。与体外结果一致，在内侧半月板失稳（DMM）小鼠模型中关节腔内给予CA5可保护关节软骨、减轻滑膜炎并限制软骨下骨恶化，且未检测到全身毒性。机制上，结构与生物物理分析表明CA5采用含G-四链体的稳定架构并结合ADAMTS5，从而实现有效的聚集蛋白聚糖酶阻断。此外，CA5经细胞内加工释放一个保守的3′tRNA衍生片段（3′tRF），该片段直接靶向Ptgs2 mRNA的3′UTR，导致Ptgs2抑制及随后的NF-κB信号衰减，从而打破ECM-焦亡反馈环路。总之，CA5代表一种双作用单分子RNA治疗剂，将适配体介导的ADAMTS5抑制与3′tRF驱动的Ptgs2沉默偶联以对抗OA发病机制，为下一代OA干预提供了模块化策略。
骨关节炎（OA）是一种以关节软骨细胞外基质（ECM）进行性破坏和慢性低度炎症为特征的退行性关节疾病，最终导致持续性疼痛和不可逆残疾。目前仍缺乏获批的疾病修饰性OA药物（DMOADs），这凸显OA进展由难以通过单节点干预逆转的自我强化分解代谢和炎症程序驱动。因此，阐明OA致病机制并开发有效且更安全的治疗策略仍是迫切需求。越来越多的证据表明，OA进展由ECM降解与炎症信号之间的相互串扰维持。IL-1β等促炎刺激抑制ECM合成代谢同时诱导基质降解酶，逐步损害软骨结构完整性。与此同时，焦亡作为一种依赖炎症小体的溶解性程序性细胞死亡形式，已成为OA关节炎症的重要放大器。危险相关和细胞因子相关信号激活软骨细胞中NOD样受体家族 pyrin 结构域包含3（NLRP3）炎症小体，导致caspase-1活化、gasdermin D（GSDMD）切割及IL-1β和IL-18等促炎细胞因子释放。这些介质进一步加重滑膜炎并上调加速ECM降解的分解代谢程序。反之，ECM破坏产生基质来源的危险相关分子模式（DAMPs），使软骨细胞对炎症小体活化和焦亡敏感。这些事件共同形成"ECM-焦亡反馈环路"，驱动进行性软骨破坏和OA发展，为旨在中断该致病回路治疗策略提供有力依据。聚集蛋白聚糖是赋予软骨凝胶样特性和机械弹性的主要结构组分。在OA中，含血小板反应蛋白基序的解整合素和金属蛋白酶5（ADAMTS5）是负责蛋白聚糖降解的主要聚集蛋白聚糖酶，其失调破坏ECM稳态并促进软骨损伤，从而确立ADAMTS5为重要治疗靶点。重要的是，ECM降解不仅削弱软骨生物力学，还产生基质来源炎症线索进一步恶化软骨细胞微环境。作为聚集蛋白聚糖降解的主要介质，ADAMTS5可能促进OA进展中基质来源DAMP样信号的产生。这些基质来源信号可参与先天免疫通路并可能促进NLRP3炎症小体启动，从而促进焦亡反应。因此，抑制ADAMTS5驱动的聚集蛋白聚糖分解可能通过减少分解代谢基质片段负担和下游炎症信号放大来减弱ECM-焦亡反馈环路，从而限制焦亡性细胞死亡。与这一原理一致，已开发出多种靶向ADAMTS5的DNA和RNA适配体。例如，形成G-四链体的DNA适配体以纳摩尔亲和力结合并抑制ADAMTS5，且靶向ADAMTS5的适配体已在临床前模型中显示疗效。OA关节微环境还以IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子持续升高为特征，这些因子通过激活经典NF-κB通路（包括IκBα磷酸化和p65核转位）驱动软骨细胞和滑膜细胞进入炎症和分解代谢状态。该信号级联放大炎症介质表达并加速OA进展，同时诱导前列腺素内过氧化物合酶2/环氧化酶-2（PTGS2/COX-2），后者是骨关节炎关节中炎症放大的中心效应器。与此同时，转移RNA（tRNA）可在多种细胞条件下通过受调控切割产生tRNA衍生小RNA（tsRNAs）。根据切割模式，这些tsRNAs包括5′tRFs、3′tRFs、tRNA半分子（tiRNAs）和内部tRFs（i-tRFs）。越来越多证据表明tsRNAs参与RNA修饰、转录后基因调控、蛋白质合成及其他细胞过程，并日益涉及包括OA在内的人类疾病。值得注意的是，tRF-3003a在健康软骨中富集但在OA软骨中逐渐减少，并与IL-6水平呈负相关，而通过tRNA
Cys过表达或tRF-3003a模拟物恢复tRF-3003a可抑制软骨细胞中IL-6表达，支持tRNA
Cys衍生片段在维持软骨稳态和抑制OA相关炎症中的功能作用。其他研究显示tRF-5009A靶向mTOR调控自噬和软骨退变，而tRF365靶向IKBKB抑制NF-κB信号并减轻OA炎症程序。最近报道tsRNA-12391在OA软骨中下调，并通过促进PINK1相关线粒体自噬减轻软骨退变，进一步支持tRNA衍生小RNA在维持软骨细胞和软骨稳态中的新兴作用。这些观察支持tRNA衍生片段作为炎症信号、细胞稳态和软骨退变内源性调节因子的更广泛作用。基于这些观察，研究人员推测一种能够结合细胞外ADAMTS5阻断与细胞内tRF介导转录后调控的多功能RNA治疗剂可能更有效抑制OA中的基质分解代谢和炎症放大。为验证这一概念，研究人员通过将人源化tRNA
Cys支架与ADAMTS5结合适配体融合，开发了双功能tRNA嵌合体CA5，从而在单一RNA分子中整合细胞外聚集蛋白聚糖酶抑制与细胞内基因调控。细胞摄取后，CA5经加工释放一个3′tRNA衍生片段，该片段抑制Ptgs2并减弱NF-κB信号，从而共同约束基质分解代谢和炎症放大。研究人员在IL-1β刺激的软骨细胞和DMM小鼠模型中评估CA5，观察到体外同时抑制聚集蛋白聚糖丢失、炎症输出和焦亡活化，体内保持软骨和关节结构。总之，这些发现为一种具有多种治疗机制的单RNA分子可中断维持OA进展的ECM-焦亡反馈环路提供概念验证，并支持开发复杂退行性疾病下一代疾病修饰干预措施的模块化框架。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：通过大肠杆菌表达平台和FPLC纯化制备tRNA-适配体嵌合体；原代小鼠软骨细胞分离培养与IL-1β刺激构建OA样细胞模型；DMM手术诱导小鼠OA模型并关节腔内注射CAP-PVAm-PLGA配制的嵌合体（0.5 mg/kg，每5天一次，共30天）；RT-qPCR、Western blot、ELISA、免疫荧光、组织病理染色（H&E、番红O/固绿、甲苯胺蓝）、micro-CT、透射电镜、圆二色谱、等温滴定量热法、RNA-seq和小RNA-seq、双荧光素酶报告基因实验及Chou-Talalay联合指数分析。
3.1 研究人员首先构建了将tRNA
Cys与ADAMTS5靶向适配体融合的嵌合体CA5，并设置CSA（tRNA
Cys融合惰性适配体）、MA5（细菌tRNA
Met融合ADAMTS5适配体）和MSA（全长阴性对照）作为对照。在IL-1β刺激的原代软骨细胞中，CA5、CSA和MA5均增加甲苯胺蓝和番红O染色强度，CA5恢复基质染色最为显著；CA5显著挽救Col2a1和Aggrecan mRNA表达并抑制IL-6，蛋白水平也证实COL2A1恢复和IL-6减少；sGAG定量进一步确认CA5介导的基质保护。剂量效应分析显示CA5以浓度依赖方式增强AGGRECAN产生，在1.5-50 nM范围内持续优于CSA和MA5，CA5的EC50最低（8.55±3.14 nM），CSA为13.31±4.32 nM，MA5为11.91±5.77 nM。Chou-Talalay分析支持tRNA
Cys支架与ADAMTS5适配体模块之间的强协同效应（CI<1）。值得注意的是，CSA虽缺乏ADAMTS5结合结构域仍减轻ECM丢失，提示不依赖适配体的支架效应；MA5活性弱于CA5则凸显tRNA
Cys支架与ADAMTS5适配体协同赋予的功能优势。
3.2 鉴于炎症小体驱动的焦亡通过IL-1β/IL-18释放放大软骨分解代谢，研究人员检测了嵌合体对IL-1β诱导焦亡级联的影响。RT-qPCR显示IL-1β强烈诱导Nlrp3、Caspase1和Asc转录本，CA5和CSA显著降低这些增加，MA5产生部分降低但未达统计学显著性。Western blot证实IL-1β刺激后NLRP3、ASC和GSDMD-N升高而总GSDMD基本稳定，各嵌合体均减弱这些焦亡相关变化。免疫荧光显示IL-1β处理的细胞中NLRP3和CASPASE1强诱导，CA5、CSA或MA5处理后显著降低。ELISA显示IL-1β大幅增加细胞外IL-18，三种构建体均抑制该升高。透射电镜进一步证实IL-1β暴露引起特征性焦亡形态（细胞肿胀、膜起泡、广泛空泡化和线粒体水肿），而嵌合体处理的软骨细胞基本保持膜完整性和细胞器架构。值得注意的是，MA5仍减轻焦亡表型，提示细胞外ADAMTS5阻断及随后的ECM稳定可间接抑制炎症小体活化；而无直接ADAMTS5结合时支架驱动构建体的ECM保护支持基质丢失与焦亡之间的相互串扰。这些结果与ECM-焦亡反馈环路一致，CA5整合支架和适配体功能最有效地中断该环路。
3.3 为促进嵌合体体内关节腔内递送，研究人员使用先前建立的软骨靶向载体CAP-PVAm-PLGA配制构建体。在DMM模型中，接受嵌合体治疗的关节与PBS或MSA相比骨关节炎恶化显著减少。组织学评估显示PBS和MSA处理小鼠内侧股骨髁和胫骨平台表面软骨细胞明显耗竭，而嵌合体给药后该损伤大幅减轻。番红O染色强度和软骨厚度恢复，CA5保护效果优于CSA和MA5。OARSI和Mankin评分显示治疗关节软骨退变等级显著降低，CA5改善最大。micro-CT分析显示PBS和MSA处理关节出现严重平台磨损、骨赘形成和骨小梁网络破坏，而嵌合体治疗限制骨赘形成并保持骨小梁组织，Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BV/TV显著改善，CA5效果最强。免疫组化显示PBS和MSA组COL2A1和AGGRECAN染色明显降低，CA5、CSA和MA5处理后大幅恢复；IL-6免疫反应性在PBS和MSA组显著升高，嵌合体给药后减弱。安全性分析未检测到治疗相关毒性或炎症激活，肝肾功能组织学正常，血清生化参数在生理范围内，循环IL-6和TNF-α水平不变。这些发现表明关节腔内递送嵌合体特别是CA5可保持DMM诱导OA中关节软骨和软骨下骨结构而无明显全身不良反应。
3.4 G-四链体（G4）基序已知可稳定RNA结构并增强核酸酶降解抗性，且已被报道为ADAMTS5适配体靶标识别所需的定义性结构特征。G4Hunter分析预测CA5和MA5含有强潜在形成堆叠鸟嘌呤四联体的富G区域，而CSA和MSA不太可能采用G4构象。圆二色谱支持这些预测：CA5和MA5显示平行G4的经典特征（265 nm附近正峰和240 nm附近负峰），CSA和MSA缺乏这些特征。为评估细胞水平靶标结合，研究人员将ADAMTS5过表达ATDC5细胞与嵌合体孵育后免疫染色，CA5或MA5预处理而非CSA或MSA降低ADAMTS5特异性免疫荧光，与适配体和抗体竞争相同或重叠表位一致。等温滴定量热法显示CA5和MA5与重组ADAMTS5特异性亚微摩尔结合，Kd值分别为（3.58±0.51）×10
?7 M和（7.73±0.52）×10
?7 M，而CSA和MSA无可检测相互作用。这些数据表明CA5和MA5采用G-四链体架构实现亚微摩尔ADAMTS5结合和强靶标结合，而非富G对照既不形成G4结构也不显示可检测相互作用。
3.5 为阐明嵌合体活性的分子基础，研究人员对IL-1β刺激的原代软骨细胞转染CA5或CSA后进行mRNA测序。差异表达分析鉴定Ptgs2为两个比较中（IL-1β vs CA5和IL-1β vs CSA）最一致下调的炎症转录本之一。GO富集显示两个数据集中差异表达基因（DEGs）与细胞外基质相关生物学过程强相关。KEGG通路分析揭示CA5和CSA转录组中NF-κB信号显著富集，提示Ptgs2/NF-κB轴的汇聚调控可能是这两种构建体共享的抗炎程序。小RNA测序显示CA5和CSA主要加工为经典tRF种类，包括5′tRFs、3′tRFs和内部tRFs（i-tRFs）。使用miRNA靶标预测（miRDB），研究人员鉴定了一个CA5/CSA产生的共享3′端tRNA衍生片段（3′tRF；5′-GTTCAAATCCGGGTGCCCCCTCCA-3′），预测与Ptgs2 3′UTR互补。小RNA-seq显示3′tRF丰度在IL-1β刺激下降低但CA5或CSA转染后显著增加。整合预测3′tRF靶标、CA5/CSA调控DEGs和 curated 焦亡相关基因集的交集分析鉴定Ptgs2为重叠候选。RT-qPCR和Western blot证实IL-1β强烈诱导Ptgs2 mRNA和蛋白，CA5或CSA显著抑制两者，MA5则无可测量影响。NF-κB通路激活的Western blot显示CA5和CSA处理细胞中p65和IκBα磷酸化降低。免疫荧光显示IL-1β和MSA处理软骨细胞中IL-1β驱动的p65核积累显著，CA5或CSA逆转而MA5未能阻止p65核转位。这些发现支持CA5和CSA经细胞内加工产生保守3′tRF靶向Ptgs2，从而抑制Ptgs2表达并减弱NF-κB活化的模型。
3.6 为确定3′tRF如何调控Ptgs2，研究人员检查小鼠Ptgs2 3′UTR并鉴定推定相互作用基序（UUUGAAA），突变为AAACUUU用于验证。双荧光素酶实验显示CA5、CSA或合成3′tRF模拟物显著降低野生型Ptgs2 3′UTR驱动的报告活性，而突变型报告消除这些效应，表明直接位点依赖性相互作用。在IL-1β刺激的原代软骨细胞中，转染3′tRF模拟物单独或联合ADAMTS5适配体（A5）显著减弱IL-1β诱导的Ptgs2 mRNA和蛋白上调，而A5单独影响极小。免疫印迹显示3′tRF和3′tRF+A5组p65和IκBα磷酸化降低，A5单独变化甚微。免疫荧光进一步证实3′tRF伴或不伴A5逆转IL-1β驱动的p65核积累，而A5未能阻断p65转位。甲苯胺蓝和番红O染色显示3′tRF+A5的ECM保持恢复最强，其次为3′tRF单独和A5单独，乱序对照无效。这些数据确立直接3′tRF/Ptgs2 3′UTR相互作用并支持嵌合体衍生3′tRF抑制Ptgs2表达和NF-κB信号从而保护软骨基质稳态的机制。
讨论部分总结：OA日益被认为是相互关联的分解代谢和炎症程序驱动的全关节疾病，这或可解释许多单靶点策略在临床研究中未能实现持久疾病修饰。RNA治疗剂包括适配体、siRNA和tRNA衍生片段提供模块化框架，可在单一分子构建体中整合细胞外靶标阻断与细胞内基因调控。CA5设计将软骨基质完整性保持与额外细胞内调控层偶联，同时约束基质分解和维持组织损伤的炎症性细胞死亡放大。CA5表现出显著模块协同并在IL-1β刺激软骨细胞中赋予强软骨保护，保持软骨基质、减弱炎症反应并强烈抑制焦亡；关节腔内给药减轻DMM模型软骨退变和整体关节病理。机制探究揭示tRNA
Cys支架加工为保守24 nt 3′tRF，以miRNA样方式直接靶向Ptgs2 3′UTR抑制其表达。PTGS2是OA细胞因子网络中中心诱导型介质，既作为经典NF-κB响应效应基因又作为前列腺素依赖性炎症放大关键驱动因子。在慢性炎症OA关节微环境中，持续细胞因子暴露维持NF-κB主导转录程序；NF-κB驱动Ptgs2上调增加COX-2衍生PGE2产生，后者通过EP1-4特别是EP4信号促进p65磷酸化并强化NF-κB活性，建立前馈环维持炎症和分解代谢基因表达。因此通过抑制Ptgs2，嵌合体衍生3′tRF预期减少PGE2-EP4信号并削弱NF-κB活化持续性，从而限制炎症小体启动并最终改善OA结局。tRNA-适配体嵌合体的定义性特征是tRNA支架不仅作为结构连接体，还作为可生理加工为具有细胞内效应活性的调控tsRNAs的活性模块。tRNA凭借保守二级/三级架构和丰富碱基修饰提供紧凑内源性样框架，可增强折叠、核酸酶抗性和细胞内处理。在该范式中效应序列编码于支架内并通过内源性加工释放，实现Argonaute相关基因沉默和病理通路协调抑制。第二个设计优势是tRNA框架可作为结构载体支持适配体结构域呈现而不擦除其功能折叠。在CA5和MA5中适配体模块保持含G-四链体架构和可测量ADAMTS5结合，而缺乏G4基序的支架对照无可检测结合。此外tRNA-适配体嵌合体具有实际制造优势，可在大肠杆菌中高水平生产，利用tRNA转录本内在稳定性和转录稳健性，原则上可实现成本效益放大、改善批次一致性和快速设计构建迭代。ADAMTS5被广泛认为是在OA中驱动早期聚集蛋白聚糖丢失和蛋白聚糖耗竭的主要聚集蛋白聚糖酶，其遗传失活显著保护不稳定诱导OA模型软骨。然而临床经验凸显单靶点聚集蛋白聚糖酶抑制的局限性，一项2期随机试验报告口服ADAMTS5抑制剂S201086/GLPG1972在52周内未显著减少MRI评估的软骨丢失或改善症状，这与异质性OA内型尽管细胞外蛋白酶阻断仍可由平行炎症和分解代谢程序维持的概念一致。除结构保护外，越来越多证据将ADAMTS5驱动基质分解与先天免疫激活联系，因为聚集蛋白聚糖和相关软骨代谢物可作为DAMP样信号参与TLR2依赖通路。总之CA5证明单一tRNA-适配体嵌合体可整合选择性细胞外蛋白酶阻断与内源性tRF驱动基因沉默实现OA病理多节点抑制。该平台通过联合靶向基质分解和炎症放大提供疾病修饰通用途径。
研究结论翻译：总之，CA5代表一种双作用单分子RNA治疗剂，将适配体介导的ADAMTS5抑制与3′tRF驱动的Ptgs2沉默偶联以对抗OA发病机制，为下一代OA干预提供了模块化策略。
