《Nature Cell Biology》：Tau monomers and fibrils escape microglial clearance via distinct cellular mechanisms
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Tau蛋白病（Tauopathies），如阿尔茨海默病（AD），是一类以微管相关蛋白tau毒性胞外形式的积聚及跨脑区播散为特征的神经退行性疾病。小胶质细胞（microglia）作为脑内驻留巨噬细胞，已知可清除并降解毒性蛋白。然而，新近证据提示小胶质细胞亦可促进
Tau蛋白病（Tauopathies），如阿尔茨海默病（AD），是一类以微管相关蛋白tau毒性胞外形式的积聚及跨脑区播散为特征的神经退行性疾病。小胶质细胞（microglia）作为脑内驻留巨噬细胞，已知可清除并降解毒性蛋白。然而，新近证据提示小胶质细胞亦可促进tau播散。为解析小胶质细胞对胞外tau应答的分子机制，研究人员采用高分辨率成像与生化方法评估不同胞外tau物种在人诱导多能干细胞（iPSC）来源小胶质细胞中的转运动力学。研究发现，tau单体（mTau）经细胞表面LRP1受体被小胶质细胞内化，但未能到达终末降解性溶酶体，而是持续被循环回收至胞外空间。相反，tau纤维（fTau）不被内化，主要通过HSPG依赖机制黏附于细胞表面，触发TLR4介导的小胶质细胞活化及促炎细胞因子释放。肝素（heparin）或抗tau治疗可减弱tau纤维介导的小胶质细胞活化。此外，阿尔茨海默病相关蛋白APOE的疾病相关变异体降低小胶质细胞与tau的相互作用，进一步减少tau摄取。综上，这些发现表明小胶质细胞通过机制上截然不同的细胞过程未能有效清除胞外tau单体与纤维，强调需要制定针对性治疗策略以增强神经退行性疾病中胞外tau的清除。
**研究背景与问题**
Tau蛋白积聚是阿尔茨海默病（AD）及其他tau蛋白病的标志性特征，与神经退行性变和认知功能下降密切相关。由过度磷酸化和聚集的tau构成的神经原纤维缠结沿特定神经环路播散，其分布模式与疾病进展平行。可溶性tau物种（包括单体和寡聚体）在可见缠结形成之前即被认为促进突触功能障碍和神经元毒性。Tau由神经元释放至胞外空间，主要通过神经元间直接传递进行播散。小胶质细胞作为脑内驻留免疫细胞，近年来被认为参与tau播散过程。小胶质细胞对胞外tau的内化被认为通过调节tau的清除与播散影响疾病进展——吞噬性摄取可减少局部胞外积聚并限制病理聚集体的播种能力，但小胶质细胞也可能通过释放内化物质作为生物活性种子或经由外泌体（exosomes）及其他胞外囊泡将tau病理传播至邻近神经元。小胶质细胞活化是AD病理的关键标志，表现为促炎细胞因子、活性氧（ROS）和补体因子的分泌。因此，小胶质细胞处于保护性清除与病理性放大的交汇点，小胶质细胞与tau的相互作用成为疾病结局的关键决定因素。
然而，既往关于小胶质细胞与tau相互作用的研究多采用荧光/报告蛋白标签标记的tau，可能影响其内化途径和胞内转运动力学；且多数研究在小鼠模型中进行，因此人源体外系统的研究可提供关于人类疾病病理的新见解。此外，tau的摄取效率和后果取决于所涉及的物种（单体、寡聚体或纤维）以及小胶质细胞参与的受体和信号通路（包括LRP1和HSPG）。因此，阐明人iPSC来源小胶质细胞与胞外tau相互作用的转运动力学、功能后果和分子机器至关重要。基于此，研究人员开展了本项研究，相关成果发表于《Nature Cell Biology》。
**关键技术方法**
研究人员采用人iPSC来源小胶质细胞（iMicroglia）培养体系，结合高分辨率共聚焦与Airyscan成像、DNA-PAINT单分子定位显微术、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、CRISPR–Cas9基因敲除、Luminex多因子检测及总tau ELISA等技术开展研究。样本队列来源包括：人iPSC细胞系iPS11和KOLF 2.1J分化的iMicroglia；原代小鼠小胶质细胞；人外周血单核细胞来源巨噬细胞（hMdM，来自3名健康供者）；以及来自2名AD患者脑皮质组织的AD-tau纤维组分。
**研究结果**
**内化的tau单体未能到达终末降解性溶酶体区室。** 研究人员用重组mTau处理iMicroglia，定量共定位发现mTau优先定位于EEA1?早期内体（63%）和LRP1?囊泡（75%），而LAMP1?晚期内体/溶酶体仅占23%。低浓度mTau处理亦获相似结果。溶酶体蛋白酶抑制剂处理不改变mTau信号或其共定位模式，而Aβ1–42在对照条件下主要定位于LAMP1?囊泡（61%）且抑制剂处理后维持共定位（66%），表明iMicroglia能将胞外蛋白如Aβ转运至溶酶体，但tau单体主要滞留于早期内体而未能到达终末降解区室。
**内化的tau单体持续循环回收至胞外环境。** 洗脱实验显示，完全更换无tau培养基后15分钟内约98%的细胞tau信号丢失，细胞裂解液中tau随时间减少而上清液中tau相应增加。原代小鼠小胶质细胞在10分钟内丢失>99%胞内tau信号，原代人单核细胞来源巨噬细胞在15分钟内信号丢失约83%。表明tau单体在iMicroglia及其他髓系细胞中不被滞留，而是快速循环回收至胞外空间。
**Tau纤维极少被内化且主要定位于质膜。** fTau处理后仅约半数细胞呈现散在染色，且fTau焦点极少与胞内细胞器标志物共定位。Airyscan增强分辨率显微镜联合IMARIS三维重建显示大多数fTau定位于细胞膜，而几乎所有mTau位于细胞膜内。非通透化细胞染色显示fTau信号与通透化细胞无显著差异，而mTau信号显著降低。洗脱实验中fTau保持结合于细胞膜而不被回收。Cryo-ET在hMdM中证实大多数tau纤维定位于质膜，罕见见于胞内区室，并观察到fTau与质膜特定接触点的蛋白密度结合。DNA-PAINT单分子分辨率成像显示mTau簇内tau分子数胞内高于质膜，而fTau簇在两处相当；膜相关fTau簇显著大于mTau簇；mTau簇含更多LRP1分子。表明在髓系细胞中fTau极少被内化且主要定位于质膜（不依赖LRP1），而mTau倾向于与LRP1受体共内化。
**疾病相关APOE4降低tau单体摄取和tau纤维与质膜的结合。** 研究人员制备了脂化APOE3、APOE3Ch和APOE4，发现疾病相关APOE4变异体较APOE3或APOE3Ch显著降低tau单体摄取和纤维结合。线扫描分析显示所有APOE亚型与tau单体和纤维均呈强共定位，但多数共定位峰含更多APOE而非tau，提示tau在APOE富集区室中水平较低。表明外源性脂化APOE4较APOE3或APOE3Ch更强地竞争介导小胶质细胞–tau相互作用的胞外受体。
**抗tau治疗减少纤维状tau介导的细胞因子释放。** fTau诱导iMicroglia产生强烈的促炎细胞因子应答（TNF、IL-6和IL-10升高），而mTau不诱导。煮沸变性的fTau完全消除细胞因子释放，且LPS滴定实验排除残留内毒素的可能性。抗tau抗体与fTau形成复合物后显著减少fTau介导的细胞因子释放，且呈剂量依赖性。抗tau处理导致tau焦点与LAMP1?囊泡共定位轻微增加，提示抗体–fTau复合物部分内化。
**LRP1为iMicroglia摄取tau单体所必需，但不影响tau纤维与质膜的结合。** CRISPR–Cas9敲除LRP1后，mTau的tau信号较非靶向对照（NTC）大幅降低，而fTau信号及fTau介导的细胞因子释放无变化。LRP1敲除不影响bulk内吞（Alexa Fluor 488-BSA信号未降低）。表明LRP1是iMicroglia摄取mTau的关键介导因子，而小胶质细胞与tau纤维的接合不依赖LRP1。
**小胶质细胞表面HSPG调节纤维状tau–细胞膜相互作用及纤维状tau介导的细胞因子释放。** 靶向敲除筛选显示除TGFBR3外，各HSPG单独敲除均导致fTau诱导的细胞因子释放适度降低，提示功能性冗余。SDC2敲除不影响mTau信号但显著降低fTau信号。肝素预处理显著降低mTau和fTau处理的tau信号及fTau诱导的促炎细胞因子释放。AD患者来源tau（AD-tau）诱导相似的促炎细胞因子应答，肝素处理亦显著减弱该应答。肝素对LPS诱导的TNF分泌略有增加，表明其抑制效应为fTau特异性。表明小胶质细胞表面HSPG在介导fTau与质膜结合及fTau介导的细胞因子应答中发挥关键作用。
**Tau纤维通过TLR4–MyD88通路诱导小胶质细胞活化。** 单独敲除TLR4和MYD88显著降低fTau介导的细胞因子释放，而TLR2敲除无影响。TLR4敲除导致膜结合tau纤维适度减少，提示TLR4参与其表面滞留；MYD88敲除不改变纤维结合。TLR2、TLR4或MYD88敲除均不影响mTau摄取。表明TLR4可能作为fTau在质膜的锚定分子，TLR4–MyD88信号轴是tau纤维诱导细胞因子释放的核心调节通路。
**讨论与结论**
研究人员在讨论中指出，人iMicroglia依赖LRP1介导tau单体摄取，且多数胞外tau单体未能到达终末溶酶体区室；tau单体在早期内体的滞留是短暂的——小胶质细胞在数分钟内即将mTau循环回收至胞外，此"快速回收"速率与LRP1受体的回收速率相似。与mTau相反，tau纤维极少见于胞内区室，大多数定位于细胞膜且多不与LRP1受体共定位。小胶质细胞对fTau降解的低效可能解释AD患者脑组织中胞外tau未被清除的现象，尤其在APOE4纯合个体中。APOE4可能通过更强地结合LRP1或HSPG，有效劫持这些细胞表面tau受体池，从而减少tau结合，导致更多游离胞外tau播种周围神经元并加速tau病理播散。研究还表明tau纤维定位于质膜对于引发促炎细胞因子应答至关重要；抗tau抗体、遗传学和药理学手段 disrupting tau纤维与细胞表面受体的接合均减少促炎细胞因子释放。机制上，TLR4–MyD88通路是调节fTau介导小胶质细胞细胞因子活化的核心角色，而既往研究提示小鼠模型中TLR2而非TLR4是关键受体，凸显了人与小鼠系统研究AD机制的可能差异。
总之，研究结果表明大多数胞外tau逃避小胶质细胞降解，tau纤维引发TLR4介导的细胞因子应答，强调需要靶向治疗以使小胶质细胞能够降解胞外tau，从而对抗AD和其他神经退行性tau蛋白病的进展。基于抗体的方法将tau纤维从质膜重新导向降解途径，既可减少胞外tau负荷又可抑制促炎信号。增强tau单体向降解 competent溶酶体转运的小分子或生物制剂可能克服观察到的快速回收现象，从而防止其重新播种至胞外空间。靶向受体–配体相互作用（如阻断tau与HSPG结合）可直接限制纤维附着和小胶质细胞炎症应答。选择性调节TLR4–MyD88信号可能解偶联小胶质细胞炎症活化与tau清除，在保留宿主防御的同时减少有害细胞因子释放。
