《BMC Complementary Medicine and Therapies》：Integrative bioinformatics and preliminary experimental validation suggest the therapeutic potential of lycorine in uterine corpus endometrial carcinoma
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子宫体子宫内膜癌（UCEC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，仍对女性健康构成重大威胁。石蒜碱（lycorine）是从石蒜科植物中分离的一种天然生物碱，因其多种药理活性尤其是抗肿瘤特性而受到广泛关注。然而，石蒜碱在UCEC中的潜在治疗靶点及作用机制尚不清楚。本研
子宫体子宫内膜癌（UCEC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，仍对女性健康构成重大威胁。石蒜碱（lycorine）是从石蒜科植物中分离的一种天然生物碱，因其多种药理活性尤其是抗肿瘤特性而受到广泛关注。然而，石蒜碱在UCEC中的潜在治疗靶点及作用机制尚不清楚。本研究采用生物信息学分析与初步实验验证相结合的整合策略，阐明石蒜碱在UCEC中的抗肿瘤机制。利用公共数据库预测石蒜碱的潜在靶点，并与来自癌症基因组图谱（TCGA）UCEC数据集的差异表达基因取交集。随后构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并采用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析研究这些靶点相关的生物学功能与通路。采用预后分析和Cox回归建立风险预测模型。进行免疫浸润分析以评估关键基因与肿瘤免疫微环境之间的关系。结果揭示了10个与UCEC相关的石蒜碱潜在靶点。功能富集分析表明这些基因主要参与胆碱能突触和神经活性配体-受体相互作用通路。进一步鉴定出三个关键基因（ACHE、MAN2B1和PNP）用于构建预后模型，该模型在生存分析中显示出中等预测性能。免疫浸润分析显示这些基因与肿瘤微环境中的多种免疫细胞群体相关。分子对接显示ACHE、MAN2B1和PNP与石蒜碱的结合能≤ ? 7.0 kcal/mol，表明结合稳定。体外实验证实石蒜碱显著抑制Ishikawa子宫内膜癌细胞的增殖。总之，本研究为石蒜碱在UCEC中的潜在治疗作用提供了新见解，并确定ACHE、MAN2B1和PNP为有待进一步研究的有前景的治疗靶点。
子宫体子宫内膜癌（UCEC）是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，具有强侵袭潜能、频繁转移和高复发率的特点，尽管手术、化疗、放疗和激素治疗等标准疗法在早期患者中改善了预后，但对晚期、复发或高危病例的疗效仍然有限。免疫检查点抑制剂（ICIs）在错配修复熟练（pMMR）型肿瘤或既往接受化疗的患者中疗效有限，因此开发创新治疗策略具有重要意义。石蒜碱是从石蒜科植物中分离的天然生物碱，具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等多种药理活性，已被报道可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，但其在UCEC中的治疗作用及机制尚不清楚。为此，研究人员采用网络药理学、生物信息学分析、GeneMANIA功能关联分析和初步体外实验验证相结合的整合策略，系统鉴定石蒜碱在UCEC中相关的潜在分子靶点和生物学通路。研究结论表明，石蒜碱在UCEC中具有潜在治疗作用，ACHE、MAN2B1和PNP可作为有待进一步研究的有前景的治疗靶点。
在技术方法方面，研究人员从HERB数据库获取石蒜碱潜在靶点并经SwissTargetPrediction平台标准化；从TCGA数据库下载554例UCEC样本和35例癌旁正常组织的RNA-seq数据及临床信息，并从CPTAC数据库提取99例肿瘤样本的基因表达与生存结局用于评估；采用R软件limma包进行差异表达分析；通过STRING v11.5构建PPI网络并用Cytoscape 3.9.1的CytoHubba插件（MCC算法）筛选枢纽基因；采用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析；利用GeneMANIA构建扩展基因网络；采用GEPIA2和KM Plotter进行表达与生存分析；采用单因素和多因素Cox回归构建预后模型并用时间依赖ROC曲线评估；采用ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA进行免疫微环境分析；采用AutoDock Vina 1.2.7进行分子对接并以重对接验证方案可靠性；采用CCK-8法、集落形成实验和RT-qPCR进行体外验证，所用Ishikawa细胞系购自认证细胞库。
研究结果如下：第一，在石蒜碱潜在靶点鉴定方面，研究人员从PubChem获取石蒜碱二维和三维结构，从HERB数据库获得15个潜在靶点，基于TCGA数据鉴定出9,201个差异表达基因（DEGs），取交集后获得10个药物相关差异表达基因（DR-DEGs），超几何检验P值为0.0078，证实交集具有统计学意义；其中ADRB2、CHRNA4和ACHE在UCEC组织中下调，其余7个基因上调，并构建了药物-靶点-疾病相互作用网络。第二，在PPI网络构建与功能富集分析方面，研究人员利用STRING数据库构建PPI网络，MAN2B1显示出最高连接度，经CytoHubba插件MCC算法分析MAN2B1获得最高MCC评分，表明其在PPI网络中处于中心位置；GO分析显示基因显著富集于蛋白质去糖基化、突触传递和乙酰胆碱受体信号通路等生物学过程，细胞组分富集于神经元致密核心囊泡、分泌颗粒腔和囊泡腔等，分子功能富集于乙酰胆碱结合、肽结合、α-甘露糖苷酶活性和酰胺结合；KEGG分析表明DR-DEGs主要富集于神经活性配体-受体相互作用和胆碱能突触通路。第三，在GeneMANIA功能关联网络构建方面，研究人员为每个DR-DEG筛选10个相关基因，去重后共纳入106个基因构建GeneMANIA扩展数据库（GMFA-ED），并对其进行GO和KEGG富集分析以进一步表征石蒜碱在UCEC中潜在相关的生物学功能和信号通路。第四，在DR-DEGs表达与生存分析方面，基于GEPIA2数据库分析发现PNP、MAN2B1、GBA和ANPEP在肿瘤组织中显著上调；总生存（OS）分析表明ACHE高表达与较差的总生存相关，无复发生存（RFS）分析表明OPRD1高表达与较差预后相关。第五，在预后模型构建方面，单因素Cox回归筛选出4个与总生存显著相关的基因，多因素Cox回归最终选定PNP、MAN2B1和ACHE三个基因构建预后模型，根据中位风险评分将患者分为高、低风险组，高风险组死亡率更高、生存结局更差，Kaplan-Meier曲线显示低风险组具有显著生存优势；热图显示PNP和ACHE在高风险组高表达，提示其作为风险因子的潜在作用；时间依赖ROC曲线显示1年、3年和5年生存的曲线下面积（AUC）分别为0.616、0.704和0.695，提示中等预测准确性，风险评分在预测UCEC患者生存方面优于其他临床病理因素，测试组1年、3年和5年AUC分别为0.680、0.749和0.642。第六，在免疫景观鉴定方面，CIBERSORT分析显示低风险组调节性T细胞、M2巨噬细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞比例较高，高风险组初始B细胞和活化树突状细胞比例较高；ssGSEA计算的28种免疫细胞评分差异分析及相关性分析显示中性粒细胞与多数免疫细胞群体主要呈负相关，而活化树突状细胞主要呈正相关；关键靶点与免疫细胞相关性分析显示PNP与调节性T细胞、静息肥大细胞和活化NK细胞正相关，与活化树突状细胞和活化肥大细胞负相关，MAN2B1与静息记忆CD4? T细胞正相关，ACHE与活化树突状细胞和单核细胞负相关。第七，在分子对接分析方面，石蒜碱与ACHE、MAN2B1和PNP最优构象的结合自由能分别为? 9.197、? 8.056和? 7.344 kcal/mol，均达到稳定结合标准（≤ ? 7.0 kcal/mol）；石蒜碱与ACHE的Tyr124、Gly122、Gly121和Ser203形成氢键，与MAN2B1的Cys493和Trp524形成氢键，与PNP的Arg84形成氢键；重对接验证显示ACHE和PNP的重对接配体结合能分别为? 11.4和? 8.2 kcal/mol，重对接构象与晶体配体构象的均方根偏差（RMSD）分别为0.177 ?和0.557 ?，均低于2.0 ?的可接受阈值，证实对接参数可靠；由于MAN2B1无实验解析的配体结合结构，未能进行重对接验证。第八，在石蒜碱抑制Ishikawa细胞增殖方面，CCK-8和集落形成实验显示石蒜碱处理显著降低Ishikawa细胞增殖能力；RT-qPCR显示12 μM石蒜碱处理组PNP和ACHE mRNA显著下调，而MAN2B1无统计学显著变化。
讨论部分总结如下：UCEC仍是重大临床挑战，新兴治疗策略如个体化肿瘤疫苗和免疫调节剂（如GDF-15）存在适用人群受限、不良反应、高成本和患者分层认识不完整等局限，因此鉴定高效低毒的新型治疗药物仍是优先事项。石蒜碱在胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌等多种癌症中显示出抗肿瘤活性，但其在UCEC中的治疗潜力和机制尚待探索。研究人员通过整合策略鉴定的靶点主要参与蛋白质去糖基化、胆碱能突触信号和神经递质相关通路，这些通路是肿瘤发展的关键调控因素——糖基化相关过程可影响受体稳定性、信号转导和细胞间相互作用，胆碱能突触通路参与调控癌细胞增殖、血管生成和肿瘤微环境动态。三个枢纽基因（ACHE、MAN2B1和PNP）是通过差异表达分析、预后意义、PPI网络拓扑、通路富集分析和既往研究生物学相关性综合评价筛选的：ACHE是多因素Cox模型中的独立预后基因并参与KEGG富集的胆碱能突触通路，石蒜碱已被报道具有弱乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性；MAN2B1因在PPI网络中连接度最高且在多因素Cox分析中保留为独立预后因素而被优先考虑，作为参与N-糖蛋白降解的溶酶体α-甘露糖苷酶与糖蛋白代谢密切相关，而异常糖基化已被广泛认为是UCEC进展的重要促进因素；PNP在多因素Cox模型中保留，参与嘌呤代谢和核苷酸周转，对快速增殖的肿瘤细胞至关重要，既往研究已将其鉴定为多种恶性肿瘤的预后生物标志物。免疫浸润分析显示高低风险组肿瘤微环境（TME）存在显著差异，低风险组富集调节性T细胞（Tregs）、M2巨噬细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞，高风险组初始B细胞和活化树突状细胞增加；这些发现对UCEC免疫治疗疗效具有直接意义，尽管ICIs（如帕博利珠单抗）改善了微卫星高度不稳定（MSI-H）子宫内膜癌患者结局，但多数UCEC为微卫星稳定（MSS）型且对ICI治疗反应有限，主要归因于以Treg浸润、M2极化巨噬细胞和丰富免疫抑制性细胞因子为特征的免疫抑制性TME，因此将TME从免疫抑制状态重编程为免疫活跃状态的治疗策略是UCEC亟待满足的需求；三个枢纽基因可能是石蒜碱抗肿瘤效应与TME重塑之间的潜在分子纽带。功能实验进一步证实石蒜碱在Ishikawa细胞中的剂量依赖性抗增殖作用，为生物信息学预测提供了实验验证。RT-qPCR显示石蒜碱显著下调ACHE和PNP mRNA而MAN2B1转录水平不变，这一差异不排除MAN2B1作为石蒜碱相互作用靶点的可能性，作为溶酶体α-甘露糖苷酶，MAN2B1作为水解酶其酶活性可受小分子结合调控而不依赖转录调控，这与分子对接预测的石蒜碱与MAN2B1有利结合相互作用一致，提示石蒜碱可能在蛋白质水平而非转录水平影响MAN2B1；RT-qPCR仅测量mRNA丰度，不能捕捉直接酶抑制、蛋白质稳定性改变或亚细胞定位变化等翻译后事件，未来需采用Western blotting、酶活性测定和直接靶点结合方法确定石蒜碱是否直接结合MAN2B1并影响其功能。与既往聚焦石蒜碱在其他恶性肿瘤中的研究相比，本研究是结合网络药理学、基于TCGA的生物信息学、免疫浸润分析和实验验证的综合整合分析。研究局限性包括：实验验证仅限于CCK-8和集落形成实验，未研究凋亡、细胞周期阻滞、迁移或侵袭；分子对接虽提示有利相互作用但直接靶点结合尚未经实验验证，未来需采用DARTS、CETSA或挽救实验确认；本研究主要依赖公共转录组数据集和体外实验，需体内动物研究和前瞻性临床研究验证石蒜碱在UCEC中的治疗疗效、药代动力学、安全性和分子机制。
研究结论翻译：总之，本研究为石蒜碱在UCEC中的潜在治疗作用提供了新见解，并确定ACHE、MAN2B1和PNP为有待进一步研究的有前景的治疗靶点。
