《Pharmacological Research》：Urolithin A Stabilizes CPT1A to Promote HUWE1-Associated NCOA4 Degradation and Alleviate Glucocorticoid-Induced Osteonecrosis of the Femoral Head
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糖皮质激素性股骨头坏死（GIONFH）以成骨受损、脂质代谢紊乱及骨小梁塌陷为特征，但其分子机制尚不清楚。本研究鉴定CPT1A介导的脂质代谢稳态是抵抗糖皮质激素（GC）诱导的成骨损伤与铁死亡的关键保护机制。单细胞分析显示，GC刺激后骨组织内成骨细胞丰度降低且脂质
糖皮质激素性股骨头坏死（GIONFH）以成骨受损、脂质代谢紊乱及骨小梁塌陷为特征，但其分子机制尚不清楚。本研究鉴定CPT1A介导的脂质代谢稳态是抵抗糖皮质激素（GC）诱导的成骨损伤与铁死亡的关键保护机制。单细胞分析显示，GC刺激后骨组织内成骨细胞丰度降低且脂质代谢相关通路发生改变。研究发现，地塞米松（DEX）在体内外均可促进脂质沉积、脂质过氧化、铁超载、线粒体损伤及成骨抑制；而CPT1A过表达可逆转上述病理改变并恢复股骨头微结构。机制上，CPT1A直接结合NCOA4并促进HUWE1介导的NCOA4 K48连接泛素化及蛋白酶体降解，从而限制NCOA4依赖性铁蛋白自噬与铁死亡。虚拟筛选结合实验验证鉴定出尿石素A（UA）为靶向并稳定CPT1A的化合物，可增强HUWE1依赖性NCOA4降解、抑制脂质过氧化与铁死亡并恢复成骨功能。总之，本研究揭示了GIONFH发病中脂质代谢-泛素化偶联机制，并提示靶向CPT1A具有治疗潜力。
研究背景方面，糖皮质激素性股骨头坏死（GIONFH）是长期或大剂量使用糖皮质激素（GC）后出现的严重骨骼并发症，常导致股骨头塌陷和不可逆关节功能障碍。目前关节保留策略和药物干预一旦骨坏死进展确立，有效改善疾病的治疗仍然有限。现有证据表明，GC暴露破坏骨修复、血管稳态、成骨细胞存活和脂质代谢平衡，共同导致股骨头结构衰竭。生理性骨重塑依赖成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的协调偶联，该平衡破坏也可能促进GC暴露后股骨头恶化。代谢失调日益被认为是GC诱导骨骼损伤的核心因素，GC暴露可扰乱成骨分化与脂质处理之间的平衡，导致异常脂质沉积、脂肪酸利用受损及成骨细胞代谢适应性下降。然而，GC诱导的脂质代谢紊乱如何转化为GIONFH中成骨细胞损伤的分子机制仍不完全清楚。铁死亡是铁依赖性调节性细胞死亡，由不稳定铁蓄积和磷脂过氧化驱动，可能提供脂质处理紊乱与成骨细胞损伤之间的机制联系。核受体共激活因子4（NCOA4）作为铁蛋白自噬的选择性货物受体，识别铁蛋白特别是铁蛋白重链1（FTH1），将铁蛋白复合物递送至自噬-溶酶体系统降解，动员氧化还原活性铁，扩大不稳定铁池，并在抗氧化防御不足时放大脂质过氧化和铁死亡。肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）是脂肪酸β氧化的限速酶，对将长链脂肪酸转运至线粒体及维持脂质代谢稳态至关重要。研究团队此前发现DEX显著抑制成骨细胞中CPT1A表达，伴随脂质代谢紊乱和成骨功能受损。本研究旨在明确GIONFH中成骨细胞内在代谢机制，并探索靶向CPT1A的治疗策略。
研究团队采用大鼠GIONFH模型和原代成骨细胞开展研究，得出结论：GC暴露破坏成骨细胞中CPT1A介导的脂质代谢稳态，导致脂质蓄积、NCOA4依赖性铁蛋白自噬、铁稳态失衡、脂质过氧化和铁死亡，最终损害成骨功能并促进GIONFH进展。机制上，CPT1A与NCOA4相互作用并促进HUWE1相关的K48连接泛素化及NCOA4蛋白酶体降解，从而抑制铁蛋白自噬驱动的铁死亡损伤。此外，鉴定出尿石素A（UA）为靶向并稳定CPT1A的小分子，可参与CPT1A-HUWE1-NCOA4轴，抑制铁死亡、恢复成骨活性并减轻体内股骨头微结构损伤。研究揭示了GIONFH中连接脂质代谢功能障碍与铁死亡的代谢-泛素化机制，提示药理学稳定CPT1A可能是GIONFH的有前景治疗策略。论文发表在《Pharmacological Research》。
关键技术方法方面，研究采用公共Gene Expression Omnibus数据集GSE261072（对照样本GSM8133819，GC暴露样本GSM8133821）进行单细胞转录组分析；分离新生Sprague-Dawley大鼠颅骨原代成骨细胞（仅使用第2代和第3代）进行体外实验；构建CPT1A或NCOA4过表达慢病毒及shCPT1A、shHUWE1等敲低载体进行基因操作；采用免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白质印迹、环己酰亚胺（CHX）追踪实验和泛素化实验分析蛋白相互作用与降解；通过抗CPT1A免疫沉淀结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定CPT1A结合蛋白；利用AlphaFold-Multimer预测CPT1A-HUWE1复合物结构并进行分子动力学模拟；采用Schr?dinger软件对71,201个化合物进行虚拟筛选；通过细胞热位移分析（CETSA）和表面等离子共振（SPR）验证靶点结合；建立两个独立的大鼠GIONFH模型进行体内验证，并采用显微计算机断层扫描（micro-CT）、组织学、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）分析。
研究结果方面，第一，GC暴露诱导成骨细胞丢失和脂质代谢紊乱。单细胞RNA测序分析显示GC暴露降低成骨细胞比例；GO富集显示差异表达基因显著富集于脂肪酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酸延伸、脂肪消化吸收和类固醇生物合成等脂质代谢相关条目，PPAR信号通路亦显著富集；GSEA显示GC处理组脂质与动脉粥样硬化通路显著富集；伪时间轨迹分析显示脂滴相关基因Plin2沿轨迹增加，而成骨标志物Col1a1和Spp1降低。体外Nile Red和Oil Red O染色证实DEX处理后细胞内脂质荧光和中性脂质沉积显著增加；蛋白质印迹显示DEX降低CPT1A和PPARα表达而上调Plin2；体内IHC显示GIONFH组Plin2阳性染色增强而CPT1A染色显著降低。结论为GC刺激减少成骨细胞丰度并伴随脂质代谢重编程。
第二，CPT1A过表达通过改善脂质代谢紊乱抑制DEX诱导的铁死亡并恢复成骨功能。Nile Red和Oil Red O染色显示CPT1A过表达或Fer-1处理明显减少DEX诱导的脂质蓄积；C11-BODIPY和FerroOrange染色显示DEX增加脂质过氧化和细胞内不稳定铁，CPT1A过表达或Fer-1逆转；透射电镜显示DEX暴露后线粒体明显损伤，CPT1A过表达或Fer-1改善；DEX增加MDA水平并降低GSH含量，CPT1A过表达或Fer-1部分逆转；蛋白质印迹显示DEX上调NCOA4并降低CPT1A和FTH1，CPT1A过表达或Fer-1降低NCOA4并恢复FTH1；DEX降低COL1A1、RUNX2和OCN表达，CPT1A过表达或Fer-1部分恢复；ALP和ARS染色显示CPT1A过表达或Fer-1改善早期成骨分化和晚期矿化。结论为DEX诱导的CPT1A下调导致脂质代谢紊乱，进而触发脂质过氧化、铁稳态失衡和铁死亡，最终损害成骨分化和矿化。
第三，CPT1A过表达减轻DEX诱导的股骨头骨丢失、脂质过氧化和成骨损伤。显微CT显示DEX处理显著损害股骨头骨小梁结构，CPT1A过表达或Fer-1干预明显改善；DEX显著降低BV/TV、Tb.N和Tb.Th并增加Tb.Sp，CPT1A过表达或Fer-1部分逆转；Masson染色显示DEX处理后骨小梁结构紊乱稀疏，CPT1A过表达或Fer-1改善；H&E染色显示DEX显著增加空骨陷窝和骨小梁塌陷，CPT1A过表达或Fer-1减少；4-HNE IHC显示DEX组阳性染色明显增强，CPT1A过表达或Fer-1显著降低；NCOA4免疫荧光显示DEX增加NCOA4表达，CPT1A过表达或Fer-1明显抑制；OCN IHC显示DEX显著降低OCN阳性面积，CPT1A过表达或Fer-1部分恢复。结论为CPT1A过表达不仅改善DEX诱导的股骨头骨微结构破坏和骨坏死病变，还通过抑制脂质过氧化和NCOA4相关铁死亡反应恢复成骨活性。
第四，CPT1A通过促进NCOA4泛素介导降解抑制DEX诱导的铁死亡信号。蛋白质组学分析显示CPT1A过表达显著改变氧化应激、成骨分化、线粒体功能和铁死亡相关蛋白表达，其中NCOA4、NOX1和EPAS1降低，COL1A1、RUNX2、PPARG和SLC7A11相对增加；KEGG富集显示差异蛋白显著富集于铁死亡、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、JAK-STAT和炎症相关信号通路；火山图显示CPT1A过表达后NCOA4显著下调。Co-IP显示CPT1A免疫沉淀物中检测到NCOA4，反之亦然；SPR证实CPT1A与NCOA4直接结合，平衡解离常数（K
D）为518.6 nM；CHX追踪实验显示CPT1A过表达细胞中NCOA4蛋白下降更快；shRNA敲低CPT1A增加NCOA4蛋白水平，MG132阻止NCOA4降解并导致其蓄积；NRF2活性操纵和NCOA4 mRNA检测表明CPT1A主要在蛋白稳定性水平通过蛋白酶体降解途径调控NCOA4；免疫沉淀显示DEX刺激下CPT1A过表达增强NCOA4泛素化，MG132进一步增加泛素化NCOA4信号蓄积。结论为CPT1A直接结合NCOA4并促进其泛素-蛋白酶体介导降解，从而抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬和铁死亡信号。
第五，HUWE1作为CPT1A相关E3泛素连接酶参与NCOA4泛素化和降解。抗CPT1A免疫沉淀物LC-MS/MS分析与IntAct、BioGRID和GPS-Uber数据集取交集，鉴定HERC2和HUWE1为候选E3泛素连接酶；考马斯亮蓝染色显示CPT1A免疫沉淀物中约对应HUWE1和NCOA4的蛋白条带富集；共转染实验显示HUWE1影响NCOA4泛素化，K48连接泛素链变化更明显而K63连接泛素化变化相对有限；结构建模预测CPT1A-HUWE1界面包含多个界面接触；Co-IP显示HUWE1与全长CPT1A和N端片段相互作用，与C端片段相互作用较弱，表明CPT1A主要通过其N端区域结合HUWE1；在HUWE1存在下野生型CPT1A进一步降低NCOA4蛋白水平，而CPT1A S72A突变体促进NCOA4降解能力减弱。结论为HUWE1是CPT1A相关E3泛素连接酶，CPT1A可能通过其N端区域和S72相关方式促进HUWE1相关的NCOA4泛素化和降解。
第六，虚拟筛选鉴定UA为靶向CPT1A并促进NCOA4泛素化和降解的小分子。通过多级虚拟筛选将71,201个化合物缩小至52个具有良好对接分数的化合物，随后对20个候选物进行功能筛选并对5个命中物进行生物学验证；细胞活力筛选鉴定出几种减轻DEX诱导成骨细胞活力丧失的化合物；蛋白质印迹显示化合物17即UA最明显恢复DEX处理下CPT1A蛋白表达；SPR显示UA与重组CPT1A直接结合，拟合K
D值为87.6 μM；分子对接显示UA占据预测的CPT1A结合口袋，对接分数为-9.7 kcal/mol；RMSF分析显示大多数CPT1A残基波动有限，RMSD轨迹提示CPT1A-UA复合物在200 ns模拟中稳定；残基级MM/PBSA分析和自由能景观进一步支持稳定且能量有利的CPT1A-UA构象；CETSA显示UA处理增加高温下可溶性CPT1A保留量并使CPT1A热稳定性曲线右移；在DEX和MG132处理下UA增强NCOA4泛素化、增加CPT1A丰度并降低NCOA4蛋白水平，这些效应被CPT1A抑制剂etomoxir减弱。结论为UA是CPT1A结合和稳定候选物，可促进NCOA4泛素化和降解。
第七，UA通过HUWE1依赖性CPT1A-NCOA4轴抑制DEX诱导的铁死亡并恢复成骨功能。蛋白质印迹显示DEX显著上调NCOA4并降低CPT1A和FTH1，Fer-1或不同浓度UA降低NCOA4并恢复CPT1A和FTH1，高剂量UA保护作用更强；FerroOrange染色显示UA剂量依赖性减少DEX诱导的细胞内铁蓄积；JC-1染色显示DEX增加JC-1单体绿色荧光并减少聚集体红色荧光，Fer-1或UA干预改善；DEX显著降低COL1A1、RUNX2和OCN表达，Fer-1或UA部分恢复；RUNX2免疫荧光证实UA恢复DEX刺激下成骨信号，而HUWE1敲低部分削弱该效应；HUWE1敲低明显削弱UA对NCOA4的抑制及恢复CPT1A和FTH1的能力；UA明显减少脂质蓄积而HUWE1敲低部分消除该抗脂质蓄积效应；UA恢复DEX抑制的COL1A1、RUNX2和OCN表达而HUWE1敲低显著削弱该成骨保护效应；ALP和ARS染色证实UA显著增强ALP阳性染色和矿化结节形成而HUWE1敲低降低UA的促成骨和促矿化效应。结论为UA恢复CPT1A表达并促进HUWE1依赖性NCOA4降解，从而抑制DEX诱导的铁蛋白自噬、脂质蓄积、线粒体功能障碍和铁死亡样损伤，HUWE1敲低削弱UA保护效应证实其通过CPT1A-HUWE1-NCOA4调控轴发挥作用。
第八，UA减轻DEX诱导的股骨头微结构损伤、脂质过氧化和NCOA4相关铁死亡反应。显微CT显示DEX处理明显降低骨小梁骨量、破坏骨小梁连续性并导致骨小梁结构稀疏，UA或Fer-1干预改善；DEX显著降低BV/TV、Tb.Th和Tb.N并增加Tb.Sp，UA处理明显改善这些参数；H&E和Masson染色显示DEX组空骨陷窝明显增加、骨小梁结构紊乱和塌陷，UA或Fer-1干预减少空骨陷窝百分比和骨小梁塌陷数；COL1A1 IHC显示DEX显著降低COL1A1阳性面积，UA或Fer-1部分恢复；UA部分恢复股骨头组织中CPT1A表达；4-HNE染色显示DEX明显增加4-HNE阳性染色，UA或Fer-1降低；UA增加SOD2荧光并减少DHE检测的氧化应激；NCOA4 IHC显示DEX增加NCOA4表达而UA或Fer-1降低NCOA4阳性面积；心、肝、脾、肺、肾H&E染色显示UA处理后无明显组织病理学异常。结论为UA干预改善DEX诱导的股骨头微结构损伤和骨坏死样病变，恢复COL1A1相关成骨基质形成，抑制4-HNE介导的脂质过氧化和NCOA4相关铁死亡反应。
讨论部分总结：本研究探讨GIONFH中成骨细胞损伤的代谢机制，发现GC暴露抑制CPT1A介导的脂质代谢稳态，导致脂质蓄积、脂质过氧化、铁稳态失衡和NCOA4相关铁死亡，最终损害成骨功能并破坏股骨头微结构。机制上CPT1A维持脂肪酸氧化并促进HUWE1相关的NCOA4 K48连接泛素化和蛋白酶体降解，从而限制NCOA4介导的铁蛋白自噬、不稳定铁释放、脂质ROS蓄积和铁死亡损伤。治疗上UA被鉴定为靶向并稳定CPT1A的小分子，可恢复DEX暴露下CPT1A-HUWE1-NCOA4调控轴并减轻GC诱导的成骨损伤和GIONFH进展。研究也指出若干局限性：CPT1A S72位点的具体修饰类型及其如何影响HUWE1相关NCOA4泛素化有待阐明；UA虽被证明结合并稳定CPT1A，但未直接测定CPT1A酶活性和脂肪酸氧化通量，因此UA应被解释为靶向并稳定CPT1A的化合物而非明确的酶激活剂；etomoxir作为药理学CPT1A抑制剂存在潜在脱靶代谢效应；UA的药代动力学特征、最佳剂量、长期安全性和不同GIONFH阶段治疗窗需系统评估；GIONFH是涉及多种细胞类型和病理因素的复杂疾病，除成骨细胞外骨细胞、内皮细胞、骨髓间充质干细胞和免疫细胞也可能参与GC诱导的病理变化，未来需采用条件性敲低模型、谱系追踪、直接脂肪酸氧化通量测定和多组学分析进一步验证该通路在骨微环境不同细胞中的作用。
研究结论翻译：总之，本研究表明GC暴露破坏成骨细胞中CPT1A介导的脂质代谢稳态，导致脂质蓄积、NCOA4依赖性铁蛋白自噬、铁稳态失衡、脂质过氧化和铁死亡，最终损害成骨功能并促进GIONFH进展。机制上，CPT1A与NCOA4相互作用并促进HUWE1相关的NCOA4 K48连接泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制铁蛋白自噬驱动的铁死亡损伤。此外，UA被鉴定为靶向并稳定CPT1A的小分子，可参与CPT1A-HUWE1-NCOA4轴，抑制铁死亡、恢复成骨活性并减轻体内股骨头微结构损伤。这些发现揭示了GIONFH中连接脂质代谢功能障碍与铁死亡的先前未被认识的代谢-泛素化机制，并提示药理学稳定CPT1A可能代表GIONFH的有前景治疗策略。
