《Pharmacological Research》：Targeting P23 by PM534 suppresses glioblastoma via disruption of SFPQ-mediated phase separation
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胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，中位总生存期（OS）不足15个月，五年生存率仅为5%。尽管采用多模式治疗策略，GBM的临床管理仍面临诸多重大挑战，包括手术切除不完全、血脑屏障（BBB）以及治疗耐药。因此，临床迫切需要开发能够克服这些
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，中位总生存期（OS）不足15个月，五年生存率仅为5%。尽管采用多模式治疗策略，GBM的临床管理仍面临诸多重大挑战，包括手术切除不完全、血脑屏障（BBB）以及治疗耐药。因此，临床迫切需要开发能够克服这些相互交织瓶颈并改善GBM患者临床结局的创新药物。P23作为HSP90复合物中的分子共伴侣蛋白，有助于维持其客户蛋白的稳定性。越来越多的证据表明，P23在多种恶性肿瘤中异常过表达。Charlotte L.等人证明P23过表达促进前列腺癌的运动和转移。此外，P23表达上调与乳腺癌患者预后呈负相关。Ma及其团队近期报道P23稳定谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），从而抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的铁死亡，支持P23作为癌症治疗靶点的潜力。尽管已有若干化合物被证明可靶向P23并在临床前研究中发挥强效抗肿瘤活性，但尚无一种进入临床试验，凸显了进一步研究新型P23靶向治疗药物的必要性。与这一需求相一致，海洋来源化合物因其独特结构和由生存环境塑造的多样生物活性，作为抗癌药物发现和新靶点鉴定的宝贵来源而受到广泛关注。迄今为止，已有16种海洋来源药物获批临床使用，其中约三分之二用于癌症治疗。特别是Trabectedin、Eribulin和Cytarabine是临床实践中最常用的药物，可作为单药或联合方案使用，凸显了海洋来源药物在肿瘤学中的巨大治疗潜力。PM534是基于先导化合物PM742通过系统构效关系（SAR）研究生成的新型合成衍生物，PM742最初从Discodermia属海绵中分离获得。然而，其在GBM中的效应仍不清楚，精确的分子靶点和机制有待阐明。在本研究中，研究人员证明PM534发挥强效抗GBM作用，尤其是在患者来源的原代GBM细胞中。机制研究表明，PM534在Cys58和Cys75位点与P23共价结合，从而通过破坏SFPQ与HSP90/P23复合物的相互作用促进SFPQ的蛋白酶体降解，最终抑制SFPQ介导的液-液相分离（LLPS）和细胞凝聚物形成。该工作为P23靶向治疗策略提供了关键见解，并支持PM534作为GBM临床管理的有前景候选药物推进。
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，中位总生存期（OS）不足15个月，五年生存率仅为5%。尽管采用多模式治疗策略，GBM的临床管理仍面临诸多重大挑战，包括手术切除不完全、血脑屏障（BBB）以及治疗耐药。因此，临床迫切需要开发能够克服这些相互交织瓶颈并改善GBM患者临床结局的创新药物。P23作为HSP90复合物中的分子共伴侣蛋白，有助于维持其客户蛋白的稳定性。越来越多的证据表明，P23在多种恶性肿瘤中异常过表达。Charlotte L.等人证明P23过表达促进前列腺癌的运动和转移。此外，P23表达上调与乳腺癌患者预后呈负相关。Ma及其团队近期报道P23稳定谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），从而抑制非小细胞肺癌（NSCLC）的铁死亡，支持P23作为癌症治疗靶点的潜力。尽管已有若干化合物被证明可靶向P23并在临床前研究中发挥强效抗肿瘤活性，但尚无一种进入临床试验，凸显了进一步研究新型P23靶向治疗药物的必要性。与这一需求相一致，海洋来源化合物因其独特结构和由生存环境塑造的多样生物活性，作为抗癌药物发现和新靶点鉴定的宝贵来源而受到广泛关注。迄今为止，已有16种海洋来源药物获批临床使用，其中约三分之二用于癌症治疗。特别是Trabectedin、Eribulin和Cytarabine是临床实践中最常用的药物，可作为单药或联合方案使用，凸显了海洋来源药物在肿瘤学中的巨大治疗潜力。PM534是基于先导化合物PM742通过系统构效关系（SAR）研究生成的新型合成衍生物，PM742最初从Discodermia属海绵中分离获得。然而，其在GBM中的效应仍不清楚，精确的分子靶点和机制有待阐明。在本研究中，研究人员证明PM534发挥强效抗GBM作用，尤其是在患者来源的原代GBM细胞中。机制研究表明，PM534在Cys58和Cys75位点与P23共价结合，从而通过破坏SFPQ与HSP90/P23复合物的相互作用促进SFPQ的蛋白酶体降解，最终抑制SFPQ介导的液-液相分离（LLPS）和细胞凝聚物形成。该工作为P23靶向治疗策略提供了关键见解，并支持PM534作为GBM临床管理的有前景候选药物推进。该论文发表在《Pharmacological Research》。为开展本研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）结合点击化学进行靶点鉴定；药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验、表面等离子共振（SPR）和微量热泳动（MST）验证靶点结合；LC-MS/MS鉴定共价结合位点；分子动力学（MD）模拟分析结合构象；免疫共沉淀（Co-IP）和蛋白质印迹分析蛋白相互作用；荧光漂白恢复（FRAP）和1,6-己二醇处理评估液-液相分离（LLPS）；原位异种移植模型评估体内抗肿瘤活性；药代动力学分析评估血脑屏障（BBB）通透性。研究样本来源包括Qilu Hospital of Shandong University的胶质瘤患者组织和患者来源的GBM#P3细胞。研究结果如下：PM534抑制GBM细胞增殖和侵袭——通过Calcein AM/PI染色、剂量反应分析、克隆形成实验、Annexin V/PI染色和3D肿瘤球侵袭实验，发现PM534以纳摩尔浓度强效抑制GBM细胞活力（IC50值分别为LN229 4.05 nM、U251 6.12 nM、GBM#P3 1.86 nM），效果优于替莫唑胺（TMZ），并诱导G2/M期阻滞、凋亡和抑制侵袭。通过活性蛋白质谱鉴定PM534的细胞靶点——设计点击化学探针PM534-P，通过ABPP结合定量蛋白质组学分析，在GBM#P3和LN229细胞中鉴定出四个共同靶点，其中P23的分子量与竞争性条带一致。P23是PM534的直接细胞靶点——DARTS实验显示PM534保护P23免受蛋白酶降解；SPR（KD=0.86 μM）和MST（Kd=1.01 μM）证实PM534与P23的高亲和力结合；免疫荧光显示PM534-P与P23共定位；Pull-down实验证实直接结合。PM534与P23的半胱氨酸残基共价结合——LC-MS/MS鉴定Cys58和Cys75为结合位点；Cys58和Cys75突变体（C58A、C75A及双突变体）显著减弱PM534-P结合；SPR显示C75A和C58A+C75A突变体无明显结合亲和力；100 ns MD模拟显示PM534稳定结合于Cys58和Cys75形成的疏水口袋，MM/GBSA结合自由能为?34.48 kcal/mol；C58和C75突变减弱PM534的抗增殖效应。P23是GBM恶性增殖和侵袭所必需的——shRNA敲低P23显著降低细胞活力和克隆形成，过表达P23促进增殖；原位异种移植显示P23敲低抑制肿瘤增殖并改善小鼠生存；IHC显示P23敲低抑制Ki67表达；临床样本分析显示P23在GBM中表达高于低级别胶质瘤（LGG），与WHO分级正相关，高表达与较短总生存期相关；单细胞RNA-seq显示P23在恶性细胞群中富集，尤其在增殖性（G2/M）恶性细胞中表达最高。PM534通过破坏SFPQ与P23和HSP90的相互作用抑制SFPQ介导的LLPS——IP-MS鉴定SFPQ为PM534处理后显著下调的P23相互作用蛋白；Co-IP显示PM534破坏SFPQ与P23和HSP90的相互作用；PM534导致SFPQ蛋白水平降低，MG132可挽救此效应，表明PM534促进SFPQ的蛋白酶体降解；P23敲低同样导致SFPQ不稳定；SFPQ含有多个RGG/RG二肽重复序列；FRAP显示GFP-SFPQ液滴具有快速可逆的荧光恢复动力学；PM534和1,6-己二醇均破坏SFPQ液滴和核凝聚物。PM534有效穿越BBB并在体内抑制肿瘤生长——药代动力学研究显示PM534在脑组织中的最大浓度为2532 ng/g，约为血浆（1277 ng/mL）的2倍；原位异种移植模型中，PM534（2 mg/kg）显著且持续抑制肿瘤生长，而TMZ（5 mg/kg）仅显示 modest 效果；HE染色证实PM534组肿瘤体积明显减小；PM534组无显著体重减轻，心、肝、肾无明显损伤；Ki67 IHC显示PM534组肿瘤增殖活性显著降低。讨论部分总结：GBM仍无法治愈，传统细胞毒治疗后不可避免地复发，过去几十年治疗进展令人失望地缓慢，主要归因于BBB和耐药性，迫切需要新的可靶向药物和预测性生物标志物。海洋来源化合物具有比陆生来源高五倍的成药性，提供结构新颖性、高效力、BBB渗透性和靶点精确性。本研究发现海洋来源PM534选择性抑制GBM细胞增殖，在GBM#P3细胞中活性最强（IC50=1.86 nM），1.25 nM PM534对GBM的抑制效果显著高于20 μM TMZ。据研究人员所知，此前尚无结构明确的海洋化合物对当前GBM标准治疗表现出如此效力。此外，PM534在神经细胞中的IC50值为17.01 nM，且不诱导NHA细胞严重凋亡，表明对GBM细胞具有有利的选择性。PM534有效穿越BBB并在原位异种移植模型中发挥抗肿瘤效应，其抗GBM疗效与marizomib（一种海洋细菌来源的蛋白酶体抑制剂，目前处于新诊断GBM的III期临床试验）相当。PM534与marizomib机制不同，为利用非重叠药理靶点的联合策略提供了有力依据。研究人员通过ABPP证明PM534在Cys58和Cys75位点共价结合P23。先前Wang等人和本研究显示α,β-不饱和酮部分作为Michael受体与蛋白质半胱氨酸硫醇形成共价键，PM534的α,β-不饱和酮部分可能为此共价反应性提供机制依据。半胱氨酸导向的共价药物具有优于非共价药物的成熟药理优势，包括延长靶点结合、优越选择性和高效力，这些特性特别适合CNS治疗。P23是HSP90的共伴侣之一，特异性结合并稳定HSP90闭合构象，有助于多种客户蛋白的稳定。然而，P23在GBM发展中的作用和潜在机制在很大程度上仍不清楚。先前研究显示P23稳定GPX4从而促进NSCLC恶性进展；Luo等人近期研究表明P23调控雄激素受体蛋白稳定性，赋予晚期前列腺癌对雄激素受体导向治疗的耐药性。本研究首次证明P23作为GBM中的新型癌基因，P23敲低后原位异种移植模型中细胞增殖和肿瘤生长受抑。重要的是，通过分析患者肿瘤组织发现P23水平与胶质瘤分级正相关，生物信息学分析显示高P23表达与GBM患者总生存期呈负相关。这些观察将P23定位为跨多种癌症类型的临床可操作分子靶点，GBM现被加入这一不断增长的列表。本研究的关键机制见解是P23维持SFPQ（一种驱动致癌性LLPS的客户蛋白）的稳定性。SFPQ含有多个Arg-Gly-Gly（RGG）三肽重复序列，这是通过LLPS形成生物分子凝聚物的已知决定因素。本研究发现SFPQ形成具有液体样特性的动态核凝聚物，FRAP分析和1,6-己二醇处理证实了这一点。值得注意的是，PM534处理通过破坏HSP90/P23/SFPQ复合物并触发SFPQ的蛋白酶体降解，有效溶解了这些凝聚物。该机制类似于化合物ailanthone通过抑制P23伴侣功能调控XRCC1蛋白稳定性。然而，据研究人员所知，PM534是首个被报道通过P23结合同时触发SFPQ降解和破坏SFPQ介导的凝聚物形成的小分子。研究结果支持以下观点：P23抑制后SFPQ稳定性丧失是主要上游事件，由此导致的SFPQ丰度降低是致癌性SFPQ凝聚物形成减少的近端原因。然而，本研究不能完全排除P23缺失对凝聚物材料性质的 minor 贡献独立于总SFPQ丰度，未来研究应探究P23缺失是否直接影响SFPQ凝聚物的材料性质。总之，研究结果表明PM534通过与P23的Cys58和Cys75共价结合发挥强效抗GBM效应，从而通过促进SFPQ的蛋白酶体降解消除SFPQ介导的核凝聚物。共价靶点结合、客户蛋白去稳定化和致癌性LLPS破坏的汇聚共同将PM534定位为机制独特且临床有前景的候选药物。鉴于P23日益被认为是多种恶性肿瘤的依赖性靶点，本工作的治疗意义可能超越GBM，值得进一步研究PM534及其类似物在其他P23成瘾性恶性肿瘤中的应用。结论部分翻译：总之，本研究揭示了GBM中先前未被认识的P23-SFPQ-LLPS致癌轴，并证明海洋天然产物PM534通过与P23共价结合破坏该轴。研究人员通过ABPP、SPR和MD模拟鉴定P23的Cys75和Cys58为PM534的直接结合位点。进一步蛋白质组学分析显示，PM534通过破坏SFPQ与HSP90和P23的相互作用抑制SFPQ介导的LLPS和细胞凝聚物形成，最终诱导SFPQ的蛋白酶体降解。因此，这些发现为P23在GBM中的致癌功能提供了新见解，并将PM534定位为创新性GBM药物发现和治疗的新型先导化合物。
