《Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine》：Mentha canadensis leaves induce anti-tumor activity in Ehrlich ascites carcinoma cells through caspase-dependent apoptosis and Bcl-2 interaction
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背景：薄荷（Bohe，Herba Menthae，Wild Mint）属于唇形科（Lamiaceae），在中医药（TCM）中具有悠久的应用历史，是一种具有多种中国传统治疗用途的芳香草本植物，亦用于食品与饮料领域。目的：本研究旨在采用计算机模拟（in silic
背景：薄荷（Bohe，Herba Menthae，Wild Mint）属于唇形科（Lamiaceae），在中医药（TCM）中具有悠久的应用历史，是一种具有多种中国传统治疗用途的芳香草本植物，亦用于食品与饮料领域。目的：本研究旨在采用计算机模拟（in silico）与体内（in vivo）试验相结合的方法，探讨薄荷叶甲醇提取物（MCLME）的抗癌功效。方法：通过分子对接与分子动力学模拟阐明MCLME来源的植物化学物与抗凋亡蛋白Bcl-2之间的结合亲和力。体内抗肿瘤疗效通过分析荷瘤小鼠中EAC细胞生长抑制、生存时间、肿瘤负荷、血液学参数、凋亡形态学及凋亡相关基因表达进行评估。结果：MCLME中鉴定出多种生物活性化合物，其中CID 60157539与CID 576686对Bcl-2表现出良好的结合亲和力，结合能分别为?8.8 kcal/mol与?8.2 kcal/mol。该相互作用可形成结构更紧密、构象在能量上有利的稳定蛋白–配体复合物，支持其作为Bcl-2抑制剂的潜在作用，并提示MCLME可能成为抗癌药物的潜在来源。MCLME在200 mg/kg与100 mg/kg剂量下分别显著抑制EAC细胞生长62.95%（p<0.001）与45.655%（p<0.001）。与对照小鼠相比，EAC荷瘤小鼠的生存期延长50.66%，肿瘤负荷降低35.24%（200 mg/kg；p < 0.001）。此外，MCLME使EAC荷瘤动物的血液参数（包括红细胞、白细胞、血小板及血红蛋白）恢复，提示其可能具有抵抗肿瘤负荷的作用。在光学与荧光显微镜下，MCLME处理的EAC细胞表现出膜起泡、染色质凝集与核碎裂（凋亡特征）。DNA片段化亦表明MCLME通过凋亡导致EAC细胞死亡。此外，处理上调了关键促凋亡基因（p53、Bax、caspase-9与caspase-3）的表达，并抑制了处理小鼠中抗凋亡基因Bcl-2的表达。结论：综上所述，本研究结果表明薄荷可能是癌症化疗的潜在资源，其表现出潜在抗癌活性并伴随caspase依赖性通路，从而支持该植物在包括癌症在内的多种疾病中的传统用途。
研究背景方面，癌症仍是全球重大公共卫生问题，预计到2050年每年新发癌症病例可达3500万例，较2022年估算值上升77%。尽管手术、化疗、放疗与激素治疗等手段不断发展，但抗癌药物毒性大、选择性差，易引发脱发、不育、神经病变、骨髓抑制与免疫力下降等严重不良反应，且存在复发与耐药问题，治疗费用高昂。中医药因可及性强、成本效益高，成为药物发现的重要线索来源。薄荷（Mentha canadensis）为唇形科多年生植物，在银翘散、桑菊饮、逍遥散、川芎茶调丸等多种中药制剂中广泛应用，具有抗炎、保肝与抗癌等报道。细胞逃避凋亡是癌症的标志性特征，抗凋亡蛋白Bcl-2通过 sequestering 促凋亡效应分子Bax与Bak、阻止线粒体外膜通透化（MOMP）及细胞色素c释放与caspase级联激活而抑制凋亡，其在多种恶性肿瘤中过表达并与治疗耐药直接相关。尽管venetoclax（ABT-199）与navitoclax（ABT-263）等合成BH3模拟物已显示疗效，但其靶向毒性、耐药机制与可及性问题促使研究人员寻找天然来源的替代抑制剂。基于前期已证实MCLME具有抗氧化与抗炎功效及该植物的传统用途，本研究采用in silico–in vivo整合策略考察其抗癌潜力，并以Bcl-2为首要靶点开展理性筛选，进而在EAC荷瘤小鼠模型中验证。
研究人员开展的研究：首先通过GC-MS分析MCLME的化学成分，随后对植物化学物进行分子对接与100 ns分子动力学（MD）模拟，靶向Bcl-2蛋白（PDB：6O0P），并结合ADMET分析评估类药性与毒性；进而在接种EAC细胞的Swiss albino小鼠中评价MCLME（100与200 mg/kg，腹腔注射）对肿瘤细胞生长抑制、肿瘤负荷、生存期、血液学参数、凋亡形态、凋亡相关基因表达（p53、Bax、caspase-9、caspase-3、Bcl-2）及DNA片段化的影响。结论表明，MCLME可通过抑制Bcl-2并激活caspase依赖性内源性凋亡通路发挥显著抗肿瘤活性，为薄荷的传统用途提供了机制证据，并提示其作为Bcl-2靶向天然产物先导化合物的开发价值。
关键技术方法概述：研究采用GC-MS（气相色谱-质谱联用）鉴定MCLME化学成分；从RCSB-PDB获取Bcl-2晶体结构（PDB：6O0P），以PyRx（AutoDock Vina）进行分子对接，SwissADME与ProTox-3.0进行ADMET与毒性预测；采用GROMACS 2025.2结合CHARMM36-JUL2022力场开展100 ns MD模拟，并以RMSD、RMSF、Rg、SASA、DCCM、PCA及MM-PBSA分析复合物稳定性与结合自由能；体内采用雄性Swiss albino小鼠（7–8周龄，25 ± 5 g）接种EAC细胞（1×10
6细胞/只，腹腔），设低剂量、高剂量、阳性对照（ifosfamide 1 mg/kg）与EAC对照共4组（n=6）；通过台盼蓝排斥法计数活细胞、血细胞计数板计数血液参数、Giemsa与DAPI/PI染色观察形态、RT-qPCR检测基因表达、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化。EAC细胞系购自印度化学生物学研究所（IICB，Kolkata，India）。动物实验经Rajshahi大学生物科学研究所IAMEBBC伦理批准（128/320-IAMEBBC/IBSc）。
研究结果：（1）MCLME的GC-MS分析：鉴定出70种化合物，主要成分（面积≥1%）包括2-Pyrazoline-3-carboxylic acid, 5-hydroxy-1-(4-methylbenzoyl)-5-phenyl-, methyl ester（16.72%）、CID 60157539对应化合物（5.20%）、2,4-Di-tert-butylphenol（5.00%）、hexadecanoic acid methyl ester（15.25%）、9,12,15-Octadecatrienoic acid methyl ester（2.59%）、methyl stearate（3.09%）与phthalic acid, octyl 2-propylpentyl ester（34.26%）。（2）分子对接分析：CID 60157539与CID 576686对Bcl-2的结合能分别为?8.8与?8.2 kcal/mol，venetoclax为?11.8 kcal/mol；化合物主要形成范德华与pi-alkyl相互作用，仅venetoclax与ASP103、TYR108形成氢键。（3）ADMET分析：CID 60157539与CID 576686分子量较低、可旋转键少（分别为7与5），水溶性优于venetoclax，胃肠道吸收更高，其中CID 60157539可透过血脑屏障，二者类药性优于venetoclax；毒性分析中CID 60157539表现优于CID 576686，因透过血脑屏障显示轻微神经毒性风险。（4）分子动力学模拟：6O0P-CID 60157539复合物RMSD低于apo蛋白且与venetoclax复合物重叠，RMSF无重大波动，Rg与SASA稳定，DCCM显示最强正相关，PCA中PC1与PC2分别占44.49%与8.83%，为各体系最高；MM-PBSA显示venetoclax结合能最高（?37.82 kJ/mol），CID 60157539因溶剂化能较高（142.9 kJ/mol）净结合能较低，但静电相互作用最强。（5）MCLME显著抑制EAC细胞生长：100与200 mg/kg剂量下抑制率分别为45.65%与62.95%，ifosfamide（1 mg/kg）抑制率为76.87%。（6）MCLME降低肿瘤重量并提高生存率：对照组肿瘤重量第20天增加47.30%，100与200 mg/kg组仅增加19.87%与12.06%；两剂量分别延长荷瘤小鼠生存期28.48%与50.66%（p<0.001）。（7）血液学参数恢复：未治疗EAC荷瘤小鼠RBC、WBC、血小板与Hb显著恶化，MCLME处理后上述参数逆转恢复。（8）凋亡形态学改变：相差显微镜下处理细胞集落减少、细胞受损；DAPI/PI染色显示处理细胞荧光强度增强；Giemsa染色可见凋亡小体形成、细胞膜皱缩、染色质凝集与碎裂。（9）促凋亡基因表达升高、抗凋亡基因表达降低：RT-qPCR显示MCLME处理上调p53、Bax、caspase-9与caspase-3，下调Bcl-2，熔解曲线单峰提示特异性扩增。（10）DNA片段化：琼脂糖凝胶电泳显示处理组呈smear状DNA降解，对照组为单一DNA条带。
讨论部分总结：本研究首次揭示MCLME通过抑制Bcl-2与激活caspase依赖性内源性凋亡通路在EAC荷瘤Swiss albino小鼠中发挥显著抗肿瘤活性，支持薄荷在中医药中用于感冒、咳嗽、发热、消化不良、哮喘与流感等疾病的传统用途。GC-MS检出的酚类、脂肪酸甲酯与杂环化合物等生物活性物质可能与其药效相关。分子对接显示CID 60157539与CID 576686结合亲和力最高，ADMET分析显示二者类药性优于venetoclax，符合Veber规则（低分子量、可旋转键<10）提示良好口服潜力；MD模拟证实复合物稳定、结构紧密。尽管二者对接评分略低于venetoclax，但综合in silico特征良好，且作为粗提物成分可能与其他植物化学物产生相加或协同作用，故进一步在EAC模型中评价其抗肿瘤潜力。体内实验显示MCLME显著抑制EAC生长、降低肿瘤负荷并延长生存期，血液学参数恢复提示其可能为癌症患者提供保护益处。形态学、基因表达与DNA片段化数据共同证实MCLME通过激活caspase依赖性内源性凋亡通路抑制EAC细胞增殖，in silico预测与in vivo观察到的Bcl-2下调和p53、Bax、caspase-9、caspase-3升高之间的一致性为计算筛选方法提供了机制可信度。局限性包括仅使用单一性别（雄性）动物、采用粗提物无法归因于单个化合物、EAC模型不能完全再现人类恶性肿瘤的复杂性；未来需开展活性成分分离与生物活性导向分级、Western blot/ELISA蛋白水平验证、高等动物模型与人类癌细胞系评估及与现有化疗药物协同作用研究。研究优势包括首次提供in silico与in vivo抗癌证据、定位广泛可及的天然化疗资源、鉴定潜在Bcl-2天然抑制剂并支持该植物的中医应用。
研究结论翻译：本研究首次提供整合in silico–in vivo证据，证明MCLME具有抗肿瘤活性，将该广泛可及的芳香植物定位为推定的Bcl-2相互作用化合物来源。计算分析预测MCLME中特定成分，尤其是CID 60157539与CID 576686，可与Bcl-2稳定相互作用，而提取物处理伴随与内源性凋亡通路激活一致的转录变化。综上，这些发现提示凋亡相关机制（可能涉及Bcl-2调节）可能参与MCLME的抗肿瘤效应。然而，仍需进一步研究以确立MCLME作为抗癌药物，包括分离其活性成分、化合物特异性生物学评价及所提出机制的蛋白水平验证。
