近红外二b区氧合成像联合双侧超声定位显微评估单侧肾缺血再灌注损伤

《Photoacoustics》：NIR-IIb oxygenation imaging and bilateral ultrasound localization microscopy in assessment of unilateral renal ischemia–reperfusion

　　

单侧肾缺血再灌注损伤（IRI）可引起同侧急性微循环功能障碍，并可能伴有隐匿性对侧受累，这对未夹闭肾作为急性期内参的稳定性构成挑战。序贯成像难以将肾脏变化与对比剂动力学、全身血流动力学及采集时序区分开来。双侧超声定位显微（ULM）评估了更深层微血管结构与灌注相关信号，而双激发比率型近红外二b区（NIR-IIb）荧光成像在同一生理窗口内量化了浅层微血管血氧饱和度（sO₂）。再灌注后，对侧内叶间动脉区域速度变异系数较基线增加19.6%，外周皮质增加30.5%。损伤肾在基线、缺血期及再灌注后的中位sO₂分别为82.4%、63.2%和80.2%，对侧分别为83.4%、80.0%和80.4%；对侧分布仍偏离基线。单侧IRI与不对称的、分期依赖的双侧ULM信号及浅层血管氧合变化相关。

肾缺血再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的常见病因，并可通过持续性微循环功能障碍、氧供需失衡及适应不良性修复促进AKI向慢性肾脏病（CKD）转化。除肾小管上皮损伤外，肾IRI可诱导内皮功能障碍和微血管闭塞，维持再灌注后低灌注，而更广泛的微血管失调和毛细血管稀疏与肾脏疾病进展相关。血清肌酐是AKI的延迟性功能指标，血清肌酐和血尿素氮可检测肾IRI后已确立的功能障碍；组织学上亦可检测到损伤肾CD31阳性血管密度降低。然而，这些发现主要源于全身生化测量或离体终点分析，无法分辨各肾的相对贡献，也难以连续捕获单侧血管夹闭、松夹及早期再灌注期间同步的双侧病理相关微循环变化及血流与氧饱和度响应。在急性单侧肾IRI实验中，未夹闭的对侧肾常被用作同体非缺血参照，以减少麻醉深度、体温、全身血流动力学、对比剂给药及成像平面选择相关的个体间变异。既往研究采用30 min夹闭建立急性单侧肾IRI，特定实验条件下对侧肾灌注被认为相对稳定，纵向ULM研究中未闭塞肾被称为"未损伤肾"以与损伤肾比较。然而，未夹闭仅定义手术条件，并不确立生理稳定性。肾代偿平衡可改变单侧IRI后直接损伤肾的恢复，而未夹闭对侧肾的远程变化亦有报道。对比增强超声（CEUS）测量依赖对比剂给药和采集时序，当两肾序贯成像时，这些变异来源可能因时间依赖性全身变化而叠加，使肾相关差异难以与共享的生理或操作变异完全区分。双侧采集将两肾置于共享的时间与全身血流动力学参照框架内。肾微血管灌注常用CEUS评估。慢速血流多普勒测量可受低频组织运动杂波限制，而定量CEUS通常依赖时间-强度曲线。ULM则定位并追踪单个血管内微泡，以重建超越声学衍射极限的微血管网络和局部血流分布。NIR-IIb荧光成像可提供血管氧饱和度的在体图谱。在延伸至NIR-IIb范围的检测波长下，组织光子散射减少可锐化血管轮廓并实现小浅表血管可视化。既往使用NIR-II成像的肾AKI或IRI研究采用了水溶性、肾可清除的H₂O₂激活探针进行荧光/光声生物标志物成像，以及ROS响应比率型NIR-II荧光探针。双激发比率型NIR-IIb氧合成像进一步利用氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白吸收光谱的波长依赖性差异。校准后，所得荧光强度比转换为血管内氧合血红蛋白饱和度（sO₂），实现血管分辨率的实时动态测量。在本设置中，对暴露肾表面成像缩短了至皮质管周毛细血管丛的光程，使跨缺血至再灌注转变的时间分辨sO₂测量成为可能。ULM与NIR-IIb结合实现了肾脏原位双模态活体成像，通过超声提供更深层微血管灌注和二维血管几何的互补读数，通过光学成像提供浅层微血管氧合信息。这些测量共同表征单侧IRI期间不同采样深度的肾血管信号。本研究在大鼠单侧肾IRI模型中建立双模态成像框架，以确定夹闭肾与未夹闭对侧肾在同一急性成像窗口内是否表现可检测的微循环变化。研究人员开发了双探头ULM协议以记录每只动物两肾夹闭前微血管信号模式，随后在缺血和早期再灌注期间量化未夹闭对侧肾的ULM衍生微血管结构、定位密度和平面投影血流指标。该可行性研究旨在量化共享采集窗口内的双侧肾ULM信号变化。研究人员进一步设计并制备了近红外-II光学纳米材料，并使用定制NIR-IIb成像系统在整合的多器官分析中测量sO₂。光学测量聚焦于浅层皮质管周毛细血管丛的氧合，并连续追踪跨不同状态（包括血管松夹及缺血至再灌注转变）的双侧肾氧合轨迹。通过结合深层组织灌注和血管几何的声学量化与浅层微血管氧合的光学图谱，该框架支持跨多个靶器官的双模态活体成像。血清生化测量和CD31阳性血管密度用于佐证模型相关损伤。为展示双模态框架的应用，研究人员在大鼠中采用同体纵向配对设计检查单侧肾IRI。测量在基线、缺血期和再灌注后序贯采集，同步超分辨超声成像实现左右肾平行观察。图2总结了双侧ULM和NIR-IIb成像的实验设计与处理流程。A图显示模型诱导和三个采集阶段，B图总结处理流程，包括运动校正、奇异值分解、微泡定位、轨迹连接和超分辨渲染。在假手术对照中，ULM衍生肾微循环指标在基线与对应缺血和再灌注的观察期之间表现大致相似的空间分布，配对相关系数为r = 0.893–0.962（补充图5）。C、D图中的基线/假手术（夹闭前）双ULM图显示基于胶囊的环形感兴趣区内的左右肾微血管。E、F图呈现定制的NIR-IIb氧合成像系统、配对650 nm和980 nm激发及sO₂帧对重建。夹闭前，双侧图显示可解释的相似性，同时保留局部扇区级差异。该基线相似性为解释后续缺血和再灌注相关变化提供了参照。在基线，双侧ULM提供了同体比较左右肾可解释微血管图的共同空间框架。两肾均使用相同的基于胶囊轮廓、同心层和钟面径向扇区分析。补充说明1和补充图4（A-F）定义了该比较的方法学基础并提供区域评估的标准化框架。基线时两肾平均血管掩模轨迹直径（Track Diam. Mean）相似。Track Diam. Mean在夹闭前于60-ROI和12-ROI分区中评估左右肾，补充图7（A、B）总结该参数的相应双侧比较。多数ROI在两肾中处于低至中等Track Diam. Mean范围。低值扇区主要局限于血管稀疏区域或轮廓边缘，扇区间无系统性侧别特异性降低。补充图10（A、B）中的Track Diam. Std显示相似离散背景，表明基线时可见血管掩模宽度的波动相当。这些测量共同定义了后续缺血和再灌注分析的双侧结构参照。由于Track Diam. Mean在缺血和再灌注分析中反复使用，该相似基线图提供了必要的结构参照。定位密度图记录了两肾夹闭前定位事件的空间分布。DensityStd使用60-ROI和12-ROI环形图评估，补充图8（A、B）总结相应双侧比较。在红色色标图中，外周肾皮质出现若干较暗扇区，而内部区域显示更平滑的空间分布。DensityStd较高区域集中于皮质区域。在补充说明3总结的血流相关框架内，DensityStd代表定位密度的空间离散度。这些图共同定义了左右肾ULM定位密度异质性的基线分布。时程衍生参数将基线比较扩展至形态学之外。补充图9（A、B）比较左右肾MTT，补充图11（A、B）比较AUC。这些指标分别对应定位密度时程的等效时间宽度和积分。红色环形MTT图大致相似，表明夹闭前两肾微泡信号时间宽度相当。扇区级变异在AUC中更明显，尤其在外周皮质区域可见局部红色增强。因此，基线成像提供了动态参照：两肾间MTT替代值大致匹配。AUC和MTT替代值总结定位密度时程的积分和等效时间宽度以供后续分期比较。血管间距和结构离散度亦显示基线相似性。补充图12（A、B）显示InterVesselDistanceStd的双侧状态，蓝色环形图中存在较深和较浅扇区。右肾夹闭期间，未夹闭肾显示ULM信号增强、定位事件负荷和时程衍生指标增加。图3（A、B）显示同一左肾在基线和缺血期的情况。夹闭后，ULM图像中外周皮质和内叶间区域的投影微泡轨迹变得更密集，更多连续高信号束跨越多个扇区。该图像级模式与同一ROI框架内可追踪微泡事件增加、时间累积增大和空间覆盖更广一致。补充图13（A-D）、补充图15（A、B）和补充图16（A-D）分别通过MTT、DensityMean和AUC支持该观察。这些指标共同表明右肾夹闭期间对侧肾ULM衍生时间、定位密度和二维几何信号的分期相关变化。AUC表现出最强的缺血相关变化之一。图3（D、E）的60-ROI环形图显示夹闭后明显红色增强。在最终比较图中，图4（A）标注内AUC为+217.0% ± 14.1 SEM^**，图5（A）标注外AUC为+128.8% ± 4.4 SEM^**。配对Hedges g_av值分别为+4.44和+6.54，表明两区域时间积分定位信号暴露的大配对效应。如补充图16（A-D）配对比较所示，夹闭后多个扇区从浅红转为深红。MTT替代变化表明时间过程亦贡献于对侧肾ULM信号模式。图4（A）显示内MTT为+109.0% ± 11.4 SEM^**，图5（A）显示外MTT为+76.8% ± 6.1 SEM^**。相应Hedges g_av估计值为6.17和4.93，表明定位密度时程等效宽度的显著标准化变化。这些数值标注与补充图13（A-D）的视觉模式一致，夹闭后多个ROI扇区从浅红转为深红。密度相关指标揭示定位事件负担的空间异质性增加。图3（G、H）显示夹闭后DensityMean增加，内外区域变化标注为+138.3%和+80.5%。如图4（A）所示，内肾区域DensityMean和密度熵分别增加+138.3% ± 3.7 SEM^**和+57.8% ± 7.1 SEM^**。图5（A）显示方向相似的外皮质模式，DensityMean增加+80.5%，密度熵增加+39.4%。DensityMean和密度熵的配对Hedges g_av值在内区域为+2.21和+1.88，在外区域为+1.16和+1.61。配对图共同表明平均定位密度增加与空间异质性增大并行。补充图14（A、B）中的DensityStd和补充图18（A、B）中的DensityEntropy在夹闭后增加，表明定位密度空间异质性增大。空间覆盖和相对血容量替代值为密度结果提供另一层解释。图4（A）中，内区域Vessel ratio、Saturation和rBV替代值分别增加+79.9% ± 3.0 SEM^*、+76.4% ± 4.3 SEM^**和+114.6% ± 6.5 SEM^*。图5（A）中，外区域Vessel ratio、Saturation和rBV替代值分别增加+68.3%、+54.9%和+68.1%。Hedges g_av条带表明内Vessel ratio和Saturation（g=+1.91和+2.34）及外Saturation（g=+1.77）的大配对效应。Vessel ratio表示血管掩模占据，而ULM空间覆盖表示至少一次接受定位到达的像素比例。rBV替代值总结相同采集和处理流程下的累积定位计数负担。补充说明5估计单侧肾动脉夹闭后固定微泡剂量的被动再分布可产生与某些读数观察变化相似量级的信号增加，因此覆盖变化被解释为ULM可检测信号负担改变。二维血管掩模和轨迹衍生图显示缺血期间检测敏感几何替代值的分期相关变化。图4（D）中，Track fragments和Skeleton vessels分别增加+85.3% ± 8.2 SEM^**和+80.5% ± 3.0 SEM^**，Track Diam. SD变化+89.4%。图5（D）中，Track fragments、Skeleton vessels和End points分别变化+55.4% ± 3.7 SEM^*、+53.0% ± 3.2 SEM^*和+47.9%。Track fragments和Skeleton vessels的配对Hedges g_av值在内区域为+2.40和+2.94，在外区域为+1.24和+2.58。补充图17（A、B）、补充图23（A、B）和补充图24（A、B）分别为Track Diam. Mean、Track Diam. Median和Track Diam. Max提供局部图像证据。补充图20（A、B）显示轨迹片段计数的伴随变化。这些检测敏感几何描述符支持夹闭期间二维ULM信号表示的分期相关变化。图4（D）显示内区域Inter-vessel distance为-50.3% ± 2.1 SEM^**，同时Track Diam. mean为+46.1%，Cumulative curvature E为+28.8%。因此内区域平均血管间距减小，配对Hedges g_av值为-4.01，与更密集的可见血管掩模占据一致。图5（D）显示外皮质Inter-vessel distance较小降低（-29.9%；g=-0.75），表明叶间ROI集外间距变化较不均匀。相反，评估InterVesselDistanceMax和InterVesselDistanceStd的补充图21（A、B）和补充图22（A、B）显示局部最大间隙和空间离散度仍可增加。因此缺血期显示整体血管掩模占据增加而局部间距异质性持续存在的成像模式。跨指标来看，缺血产生一致的对侧肾ULM特征。AUC和MTT增加表明累积增强和等效驻留时间增加。DensityMean、Saturation和rBV替代值增加表明定位事件负担和空间覆盖增加。较高轨迹片段和骨架连通分量计数表明接受轨迹数和掩模连通性变化；检测性增加或碎片化均可贡献。右肾夹闭后，ULM揭示对侧左肾增强负担、时间积分信号、定位密度、空间覆盖和可见网络替代值的协调增加。右肾夹闭期间，对侧肾显示定位事件负担和可见网络指标的并发变化。再灌注分析检查右肾夹闭解除后对侧左肾是否恢复其基线ULM特征。如图3（N）所示，与对照和假手术组相比，IRI组显示血清肌酐和血尿素氮显著升高，伴CD31阳性血管密度明显降低。对照与假手术组间无显著差异。这些发现表明肾缺血再灌注诱导功能性肾损伤和微血管稀疏/内皮损伤（n=5）。血清肌酐升高表明肾缺血再灌注损害肾滤过和排泄功能，支持AKI模型成功建立。血尿素氮升高表明肾缺血再灌注后含氮代谢物肾清除降低，提供功能肾损伤的生化证据。CD31阳性血管密度降低表明肾缺血再灌注后肾微血管内皮CD31信号减少，与微血管稀疏、毛细血管脱落或闭塞、内皮损伤及灌注血管床减少一致。图3（B、C）显示左肾在缺血和再灌注期的情况。松夹后，信号束和外周轨迹仍可见，但总体密度低于夹闭期间。补充图25（A、B）显示松夹前后MTT替代图。红色扇区变浅，表明时间宽度减小。与图3（E、F）、图3（H、I）和图3（K、L）一致，松夹后AUC、DensityMean和Track Diam. Mean降低。松夹后AUC下降但仍高于基线参照。图3（E、F）显示从缺血到再灌注AUC降低。图4（C）显示内AUC为-30.2% ± 2.8 SEM^**，图5（C）显示外AUC为-39.9% ± 2.0 SEM^**。这些结果表明内叶间区域和外皮质区域定位信号累积暴露均从夹闭升高状态降低，外区域降低更大。在基线-再灌注面板中，图4（B）显示内AUC为+121.3% ± 2.0 SEM^**，图5（B）显示外AUC为+37.6% ± 2.8 SEM^**。这些标注表明松夹后AUC仍高于基线，内区域残余升高更明显。因此AUC在再灌注后部分正常化但未完全恢复至基线。MTT替代值遵循与AUC相同的模式。补充图25（A、B）和再灌注裁剪图显示松夹后红色扇区变浅，表明等效时间宽度短于夹闭期间。然而松夹后MTT仍高于基线，表明微泡信号驻留或时程宽度未完全重置。AUC和MTT替代值的残余升高提示早期再灌注期间对侧肾持续时程增宽或定位信号增强持续。因此再灌注减弱但未完全逆转ULM检测的微血管改变。松夹后DensityMean和DensityEntropy降低，外皮质区域降低更完全。图4（C）中，内DensityMean和密度熵分别变化-36.2% ± 6.0 SEM^*和-16.0%。图5（C）中，外DensityMean和密度熵分别变化-50.0% ± 2.8 SEM^*和-29.8% ± 1.9 SEM^**。这些结果表明松夹后平均定位密度和空间复杂度均从缺血状态降低，外周皮质区域降低更强。与基线相比，内叶间区域DensityMean保留残余上移（+52.1%），而外周肾皮质接近基线或略低于基线（-9.7%）。这些数据支持早期再灌注期间区域特异性ULM衍生信号再平衡。松夹后Saturation和rBV替代值显示不同恢复模式。在外区域，图5（B）显示rBV替代值和Saturation分别为-3.3%和+6.8%，表明再灌注后外皮质覆盖接近基线。相反，内区域保留残余Saturation增加（+51.3% ± 4.1 SEM^*）。从缺血到再灌注，外Saturation和rBV替代值分别降低-31.1% ± 2.0 SEM^*和-42.5% ± 2.5 SEM^*，而内相应变化为-14.2%和-28.8%。该区域分歧表明早期再灌注期间外皮质信号负担指标比内叶间指标更强烈正常化。再灌注期间速度相关指标与密度指标分歧。该分歧反对将再灌注解释为统一恢复至基线。图4（C）和图5（C）显示松夹后AUC和DensityMean降低，而速度分布指标保留明显残余模式。从缺血到再灌注，内和外区域Velocity max分别增加+38.6% ± 1.7 SEM^**和+33.1% ± 7.3 SEM^**。配对Hedges g_av值为+1.75和+3.48，支持ULM观察中松夹后速度再分布的大效应。图4（B）亦表明残余差异。松夹后定位负担指标下降，而若干投影速度分布指标仍偏离基线。该模式与再灌注期间投影微泡流的早期再分布相容。再灌注后结构指标显示残余差异。图4（F）中，Track fragments、Skeleton vessels和Inter-vessel distance分别变化-26.8% ± 6.9 SEM^*、+70.7% ± 1.8 SEM^**和-33.3% ± 5.0 SEM^*。图5（F）中，Track fragments、Skeleton vessels和Track Diam. mean分别变化-39.3% ± 3.0 SEM^*、+29.3% ± 3.8 SEM^*和-17.1% ± 1.8 SEM^*。这些结果表明轨迹片段数从缺血状态降低，而骨架连通分量保持升高或继续增加，外区域宽度替代值降低。如图4（E）所示，再灌注后Skeleton vessels仍升高+208.0% ± 5.5 SEM^**。图5（E）呈现外区域平行残余升高（+97.9% ± 3.2 SEM^**），配对Hedges g_av值为+5.08和+3.23。这些发现提示骨架化信号表示在早期再灌注窗口内未恢复至基线模式。再灌注期间Track Diam.和血管间距相关指标显示部分恢复。图3（K、L）显示从缺血到再灌注Track Diam. Mean降低。这表明宽度替代值相对于缺血期降低。外区域甚至低于基线参照，而内区域保留轻度残余上移。血管间距亦显示区域特征。如图4（B、E）和图5（B、E）所示，松夹后可见血管区域和间距结构未完全恢复至基线水平。总之，再灌注产生对侧肾若干ULM指标的部分、区域依赖性正常化，并不反映统一恢复至基线。再灌注逆转缺血期观察到的增强状态，但恢复因区域而异。外周皮质区域密度和覆盖指标更接近基线，而内叶间区域保留时间相关、增强相关和骨架网络替代值的残余变化。因此单侧缺血再灌注与对侧肾早期ULM可检测微血管改变相关。作为重要成像模态，NIR-IIb sO₂成像与U-Net辅助血管分割相结合，以量化在体动态双侧皮质氧合。在基线/假手术、缺血期和再灌注后测量损伤肾和对侧肾的像素级血管sO₂分布（图6（A-F））。跨代表视野，分割血管的最小稳定表观宽度范围为70.38至100.54 μm。对侧肾代表图显示基线/假手术时皮质微血管sO₂高且相对均匀（图6（A））。尽管该肾未直接夹闭，缺血使血管sO₂向较低值偏移并增宽其空间分布（图6（B））。再灌注后，对侧图仍更接近缺血模式而非基线/假手术，并保留较低氧合和空间异质性（图6（C））。中位sO₂从基线83.4%降至缺血期80.0%，再灌注后略升至80.4%（图6（H））。大鼠水平平均IQR从基线2.165个百分点增宽至缺血期4.820个百分点和再灌注后5.615个百分点。这些发现描述可量化对侧血管像素间的持续再分布。中位数的轻微恢复伴随氧合分布的持续增宽。损伤肾在皮质管周毛细血管丛内显示明显的分期相关偏移。代表图显示基线/假手术时皮质微血管sO₂高（图6（D））。缺血期间sO₂显著降低，使血管网络处于广泛低饱和状态（图6（E））。再灌注使中位数向基线恢复，尽管低氧区域和空间异质性仍可见（图6（F））。中位数从基线82.4%降至缺血期63.2%，再灌注后恢复至80.2%（图6（I））。大鼠水平平均IQR从基线3.141个百分点扩大至缺血期16.514个百分点，再灌注后仍升高至10.436个百分点。因此再灌注后分布仍与基线不同。对每肾评估三个阶段的配对分布距离（图6（J、K））。在损伤肾中，基线至缺血的Wasserstein-1距离为19.3个百分点，Jensen-Shannon散度为0.81比特。这些值表明合并像素分布间的差异。缺血至再灌注的Wasserstein-1距离仍为13.4个百分点。结合再灌注后较高中位sO₂，该距离反映向较高氧合的大幅再分布。然而基线与再灌注仍相隔Wasserstein-1距离5.92个百分点和Jensen-Shannon散度0.346比特。损伤肾分布在再灌注后向基线偏移但未与基线分布重合。对侧分布在再灌注后亦未恢复至基线（图6（J、K））。基线至缺血比较产生Wasserstein-1距离5.0个百分点和Jensen-Shannon散度0.548比特。基线至再灌注值仍为4.57个百分点和0.465比特。相反，缺血与再灌注仅相差Wasserstein-1距离0.522个百分点和Jensen-Shannon散度0.0721比特。根据这两个像素分布指标，再灌注后分布仍更接近缺血分布而非基线。中位sO₂的轻微增加代表小的位置偏移而无整体分布形状恢复。损伤肾的动态NIR-IIb sO₂成像显示松夹后皮质管周毛细血管丛的渐进性再氧合（补充图29（A-E））。缺血期间，逐帧空间平均sO₂（以分数表示）尽管反复振荡仍保持相对较低（时间中位数0.641；标准差0.049）。松夹产生大的瞬时波动，随后持续增加并在再灌注期间稳定。代表空间图佐证该轨迹，显示晚缺血期较低氧合、松夹期间异质性响应及早期和稳定再灌注期间更广泛恢复。在代表轨迹内，稳定再灌注具有较高时间中位sO₂（0.853）和较低时间变异性（标准差0.014）较缺血期。代表峰峰间隔在缺血期为0.424 s，稳定再灌注期为0.394 s。在所述分析内，这些间隔可作为呼吸和循环稳定性的描述性指标。时空变化与再灌注后皮质微血管氧合恢复一致。在两肾中，NIR-IIb sO₂成像显示损伤皮质微血管明显且不完全可逆的脱氧，以及对侧肾较小的持续异常。再灌注后，损伤肾中位sO₂显著恢复，而两肾均值和median值仍低于各自基线。分布距离、离散度和多数空间异质性指标亦仍偏离基线。该组合模式与单侧缺血再灌注期间肾微血管氧合的双侧再分布一致。本研究评估了用于监测成对器官耦合响应的整合双模态在体成像框架。对于声学成像，使用同步双探头采集、自动肾分区和多参数分析评估双侧肾ULM的技术可行性。NIR-IIb成像绘制肾前表面浅层微血管血氧。两种模态共同提供单侧缺血和再灌注期间双侧肾损伤的详细信息。通过定位和追踪血管内微泡，ULM实现肾微循环的超分辨可视化和定量表征。肾IRI涉及微循环功能障碍、内皮损伤、异质性毛细血管灌注和再灌注后无复流，均促进AKI发生和进展。双探头设计使夹闭肾和对侧肾在一个对比剂动力学窗口和同期全身血流动力学条件下双侧观察。该设计减少配对肾比较期间微泡浓度时间变化、重复注射变异性、探头耦合差异和采集时间漂移的混杂。自动肾分区将每个二维切面标准化为可重现区域单元。因此血管覆盖和拓扑相关读数可在区域和全肾尺度一致比较。NIR-IIb成像显示缺血期间损伤肾浅层血管氧合明显降低。该模式与尽管持续代谢氧消耗但氧输送受限一致。异质性局部灌注亦可产生低氧斑块，延伸氧合分布下尾并增加空间异质性。再灌注后，损伤肾氧合显著增加，尽管离散度和分布距离仍与基线不同。再灌注期间中位sO₂接近基线而IQR和分布距离仍偏离。该时间分离可能反映异步微血管再开放、局灶低灌注、周细胞介导毛细血管收缩、内皮肿胀或微血管阻塞。在该双成像框架内，双侧ULM揭示对侧肾灌注替代值改变，NIR-IIb成像显示持续氧合异常。单侧肾动脉夹闭期间，对侧肾显示早期再灌注期间可能未完全恢复至基线的IRI相关ULM特征。在单侧IRI模型中保留未夹闭肾维持残余肾功能，同一肾可作为内部成像比较器。然而既往研究表明单侧损伤可在损伤肾和对侧肾产生持续血流动力学和炎症效应。这种双侧耦合可能涉及肾间炎症信号和肾血流再分布。对侧氧合的轻度下降与ULM信号和二维可见网络指标的持续分期相关差异同时发生。主要方法学贡献是用于检查成对器官耦合的探索性原位双模态范式。双侧ULM与NIR-IIb成像结合可支持深层微血管耦合和浅层血氧空间远程变化的多器官分析。主要目的是评估双模态平行成像框架量化单侧损伤期间双侧变化的技术可行性。本研究受小样本量限制。统计分析表征实验阶段间测量参数观察变化的方向和幅度，为未来研究提供初步证据。当前二维ULM采集采样微血管轨迹和平面内速度分量，未解析完整三维肾血管网络。再灌注时，先前夹闭肾在松夹和移除期间受机械扰动，可能移动声学成像平面（补充图6）。因此跨阶段维持相同成像平面仍是当前设置的局限。几何描述符依赖平面选择、微泡采样密度和检测效率。速度估计额外受血管方向、局部微泡密度、轨迹连接参数和平面外运动影响。这些参数表征检测到的血管网络，而解剖学解释需后续研究独立验证。手术操作亦可改变NIR-IIb氧合分析中包含的血管区域，使空间配准和相应血管重复观察复杂化。因此分析聚焦于各阶段可见血管内氧饱和度（sO₂）的空间分布，跨阶段血管级对应有限。这些分布间差异可能反映氧合变化和采样血管群体变异。未来研究可将高倍光学成像与组织稳定和验证配准结合，以支持相应血管区域的重复测量。血氧饱和度分布分析亦受模型诱导期间组织几何变化限制。用于诱导缺血的手术程序可改变成像阶段间组织和血管相对位置，限制可靠像素级空间配准和血管匹配。因此本研究强调手术干预前后成像区域内整体血管氧合状态及其分布变化；单个血管的纵向氧合变化仍未解决。更稳定的组织固定或同时双模态测量可在未来研究中实现血管特异性氧合追踪。这些方法亦可支持活体组织更详细的时空表征和模型性能评估。所有动物程序经北京大学机构动物护理和使用委员会批准（方案AAIS-ZhangJ-9）。研究使用急性大鼠单侧肾缺血再灌注损伤模型，并进行双侧ULM和NIR-IIb相位匹配的受试者内纵向实验。健康雄性Sprague-Dawley大鼠从可用健康动物库中随机选取，购自Charles River Laboratories（中国北京）。大鼠10周龄，体重约300–350 g。双侧ULM成像队列包括五只大鼠。使用雄性动物以减少该小样本可行性研究中性别相关生物学变异。动物为生物学实验单元。研究使用配对、同体双侧肾ULM设计。未进行独立随机分组。右肾指定为固定夹闭侧，左肾作为同体未夹闭比较器。样本量基于既往肾超分辨超声研究、同步双侧肾成像技术可行性和最小化动物使用原则确定。除供应商确认健康状态、术中人道终点和完成双侧肾ULM采集能力外，未预定义额外动物级排除标准。入组后无动物被排除。用4%异氟烷氧气诱导麻醉，1.5%异氟烷氧气维持。动物置于设定37 °C的恒温加热垫以维持体温。实验中记录呼吸模式、总体运动、趾捏回缩反射、平均动脉压、心率。平均动脉压维持85–105 mmHg，心率350–400次 min^?1。仅在达到稳定麻醉深度、呼吸运动无突然变化、血压和氧饱和度在预设范围内且两探头成像平面稳定后启动ULM采集。ULM成像实验作为急性终末程序进行，动物未从麻醉中恢复。实验结束时，动物在深麻醉下经戊巴比妥钠过量安乐死。通过双侧胁部切口暴露左右肾及其相应肾蒂。暴露组织用温热无菌纱布保持湿润。右肾蒂用无创微血管夹闭塞30 min。使用固定右侧夹闭策略以保持两探头空间关系并维持期内配对比较一致性。肾苍白用于确认缺血。松夹后肾颜色恢复和微泡灌注信号恢复用于确认再灌注。ULM数据在基线、缺血期和再灌注后采集。基线采集在右肾蒂夹闭前进行，作为同手术准备下同体纵向假手术状态参照。缺血期采集在30 min右肾蒂闭塞期间进行。再灌注期采集在松夹和确认再灌注后进行。每期从每肾获得一次连续ULM采集。每次采集包括以400 Hz采样的15,000帧。NIR-IIb成像窗口与超分辨超声成像窗口平行相位匹配，如补充图1所示。SuperVue-MB微泡（南京 Leapsonics Medical Technology Co., Ltd.）具有全氟丙烷气核和脂质壳，与已发表制剂一致。微泡原液浓度为1.8 × 10⁹ MBs ml^?1，实验前稀释至2 × 10⁸ MBs ml^?1，与用于超分辨超声成像的相关自制制剂一致。每次注射通过尾静脉给予200 μl稀释微泡悬浮液。基线、缺血和再灌注期注射相同剂量的新鲜微泡以减少单次推注期间衰减导致的解释偏倚。在启动下一期前，允许前次注射残余微泡信号恢复至接近注射前水平。NIR-IIb成像试剂来源如下。Sigma-Aldrich提供稀土和氟化物前体醋酸铒(III)水合物、氧化钇(III)、三氟乙酸钠和氟化铵；反应介质油酸（OA）和1-十八烯（ODE）；氢氧化钠；偶联组分1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和4-(二甲氨基)吡啶；聚丙烯酸（PAA；1.8 kDa）和聚(马来酸酐-alt-1-十八烯)（PMH；30-50 kDa）；4-吗啉乙磺酸（MES）和2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇（Tris-base）；溶剂环己烷和氯仿。这些试剂未经进一步纯化使用。Alfa Aesar的三氟乙酸（99%）按收到使用。SINOPEG提供甲氧基聚乙二醇胺（mPEG-NH₂；5 kDa）和八臂聚乙二醇胺（8Arm-PEG-NH₂；40 kDa）。NaErF₄@NaYF₄ pEr核壳纳米颗粒按程序制备。含Er(CH₃COO)₃、NaOH和NH₄F的OA/ODE反应介质在氩气下高温共沉淀，产生NaErF₄核。核纯化后，CF₃COONa和Y(CF₃COO)₃在氩气氛下于OA/ODE中热分解以沉积NaYF₄壳。该壳沉积序列共进行两次。产物用环己烷/乙醇洗涤并保留在环己烷中约80 mg ml^?1直至表面修饰。使用交联聚合物协议赋予合成pEr纳米颗粒水分散性和胶体稳定性。PMH通过溶剂蒸发沉积到疏水纳米颗粒上，4-(二甲氨基)吡啶促进其转移至水中。离心后，EDC介导的与八臂-PEG-NH₂的酰胺偶联交联PMH包覆纳米颗粒。残余羧基在透析和浓缩前用Tris-base封端。随后通过EDC化学偶联PAA，接着用mPEG-NH₂和八臂-PEG-NH₂进行PEG化。剩余羧基封端，聚集体通过离心和过滤清除。最终聚合物修饰pEr纳米颗粒配制成10 mg ml^-1水分散液并4 °C储存。血氧饱和度（sO₂）由ratio_650:980使用先前报道的校准计算：????₂=0.986?3.407×??^{(?4.156×??????????_650:980)}。双侧肾成像使用Verasonics Vantage 256系统和两个L22-14v线性阵列探头。发射频率15.625 MHz，探头间距0.100 mm，有效孔径约12.8 mm，成像深度0–30 mm。每个探头使用七个均匀间隔的交替角度采集，跨度?20°至+20°。左右探头交替序列采集，每个配对采集周期包括14个发射事件。ULM处理流程遵循补充图2所示双探头管线。来自Probe A和Probe B的原始IQ数据或包络检测图像首先校正至共享时间基准，包括触发对齐和帧配对。数据流随后解复用，两探头序列独立处理。每个数据流标准化至0.5 λ空间采样间隔和400 Hz时间采样率。组织主导相干背景通过低秩时空分解抑制，随后进行轻高斯去噪，轴向、横向和时间维度σ分别为0.3、0.3和1.5。候选微泡事件从局部强度极大值识别。每帧保留最多100个候选事件。在5 × 5邻域内评估局部复杂性。该邻域内超过七个局部峰的候选事件被丢弃，以减少噪声、重叠微泡或复杂背景信号导致的错误定位。亚像素中心用梯度收敛估计器估计。定位稳定性通过中心位移标准评估，中心位移大于2.5像素的候选事件被排除。通过质量控制的定位保留轴向位置、横向位置、帧索引和强度。轨迹通过最近邻分配连接，最大连接距离8像素，不允许时间间隙。轨迹需持续至少20帧；较短轨迹被移除。过滤的定位和轨迹累积在8×细化网格上以生成微血管密度图、方向编码血流图和速度幅度图。ROI分析使用肾胶囊引导分割策略。B模式图像上的肾轮廓用于生成肾特异性掩模，从中导出归一化向内距离坐标和钟面角度扇区。外环对应邻近肾胶囊的外周肾皮质，而内环延伸至与叶间动脉相关区域。ULM参数的统计总结和解释见补充说明3和4。双侧ULM统计分析使用SPSS 23.0和Origin 8.0进行。统计分析使用n = 5动物队列进行跨阶段受试者内比较，每只大鼠作为生物学实验单元。基线、缺血和再灌注构成同一动物内重复测量序列，即受试者内纵向实验。配对阶段对比报告为动物水平阶段均值间百分比变化。伴随SEM代表该基于比率百分比对比的标准误，由两阶段配对动物水平测量估计。该方法保留大鼠内协方差结构。阶段依赖差异通过受试者内纵向设计中三采集阶段的重复测量ANOVA评估，随后进行Tukey多重比较检验用于基线-缺血、基线-再灌注和缺血-再灌注对比。鉴于五鼠可行性设计，所得P值解释为探索性统计证据。显著性表示为ns（p ≥ 0.05）、*（p < 0.05）和**（p < 0.01）。效应量报告为每个配对对比的Hedges g_av。该估计使用动物水平配对阶段差异，用两相应阶段分布的平均离散度标准化，然后应用适合五鼠设计的小样本Hedges校正。Hedges g_av符号遵循阶段对比方向，正值表示后期阶段指标值较高。Hedges g_av较少受大鼠内差异变异性驱动，因此为跨动物高度一致变化的重复ULM测量提供更稳定幅度估计。0–0.2可忽略；0.2–0.5小；0.5–0.8中；0.8–1.2大；>1.2极大。肾氧饱和度（sO₂）在五只大鼠基线、缺血和再灌注期评估。每阶段每肾分析使用30–100% sO₂范围内有限像素值。线性插值提供第25和第75百分位数（Q1和Q3）。异质性通过四分位距（IQR；Q3 ? Q1）量化，以百分点表示。每阶段每肾一个IQR，每只大鼠构成生物学重复（n = 5）。阶段特异性平均IQR对所有权重相等。逐点95%置信区间使用大鼠间标准误和四自由度Student t分布。对每肾，双侧配对t检验比较基线至缺血（B–I）、基线至再灌注（B–R）和缺血至再灌注（I–R）间IQR。每次比较使用五个大鼠内配对和四自由度。Holm逐步程序分别调整对侧和缺血肾的三个P值，每肾内控制族错误率0.05。显著性标注表示指定比较的Holm调整P值（ns，P ≥ 0.05；*，0.01 ≤ P < 0.05；**，P < 0.01）。24 h血生化验证在来自同实验批次的非成像大鼠中进行。手术验证组动物接受相应手术程序和微泡注射。对照、假手术和IRI验证组各包括五只大鼠（补充图1D）。从下腔静脉采集2 ml血样，分离血清用生化分析仪分析。血清肌酐（Cr/Scr）和血尿素氮（BUN）作为肾相关血液指标测量。由于肾损伤后血清肌酐可能需24–36 h升高且在大鼠肾IRI时程研究中血清肌酐和BUN均在约24 h达峰，在30 min缺血暴露后24 h再灌注采集终末血以评估AKI相关功能障碍。损伤侧肾用10%福尔马林固定并切片3 μm厚。CD31阳性面积使用ImageJ在10×放大采集的至少五个视野量化。