基于信息论框架从单细胞RNA与T细胞受体测序推断T细胞动力学

《Nature Genetics》：An information-theoretic framework for inferring T cell dynamics from single-cell RNA and T cell receptor sequencing

单细胞T细胞受体（TCR）库测序可同时分析基因表达与TCR序列，提供T细胞表型多样性与克隆动力学的核心gistered（配对）测量。然而，用于克隆型与表型联合建模的原则性概率框架仍然有限。研究人员提出TCRi，一种分层贝叶斯信息论框架，从配对的单细胞转录组与TCR测序数据推断遗传克隆型与转录表型之间的联合概率分布。TCRi将表型分配视为概率推断问题：变分自编码器将单细胞表达嵌入结构化潜在空间，分层贝叶斯模型通过跨克隆型、患者和协变量的原则性信息共享学习克隆型特异性表型分布。基于这些分布，TCRi计算信息论量：克隆型熵、表型熵、表型流以及克隆型与表型之间的互信息。当TCRi应用于四个真实世界数据集（包含来自接受抗PD-(L)1免疫检查点阻断治疗的癌症患者的167,118个CD8 T细胞）时，互信息成为治疗反应的稳健判别指标。

**研究背景与问题**：人类T细胞受体（TCR）库因V(D)J重组可产生约10⁸–10¹⁰种不同DNA基因组克隆型，每种克隆型可识别一组抗原且具有不同特异性和交叉反应性。同时，单个T细胞具有决定其功能的广泛表型多样性。尽管克隆型和表型多样性巨大，感染或抗癌免疫治疗的应答往往由总库中的小亚群驱动，识别和表征这些亚群在实验和计算上仍具挑战性。TCR互补决定区3（CDR3）测序使TCR库的统计定量成为可能，TCR库多样性已成为多种癌症类型的临床信息特征。然而，批量TCR-seq方法无法直接洞察特定T细胞的功能状态，也无法将TCR库中的抗原识别与特定表型关联；单细胞RNA测序（RNA-seq）虽可识别转录特征和T细胞亚群，但单独无法直接确定T细胞群的生物学影响与抗原识别的关联。现有整合TCR与表型状态的计算方法（如Scirpy、克隆型邻居图分析CoNGA、Tessa、mvTCR）通常依赖T细胞群向表型聚类的先验离散化或选择代表性基因表达（GEX）谱，且尚无单一度量成为共识标准。因此，研究人员开展本研究以建立克隆型与表型联合分布的概率框架。

**研究内容与结论**：研究人员提出TCRi，一种克隆型–协变量分层贝叶斯框架，推断T细胞克隆型与单细胞转录表型之间的联合概率分布以计算信息论量。TCRi在克隆型和协变量（如组织、时间点或治疗）两个层次运作：克隆型层次的表型谱从数据驱动的Dirichlet先验混合中抽取；协变量层次的表型分布通过以其父克隆型为条件的分层Dirichlet先验抽取。变分自编码器将每个细胞的GEX谱嵌入低维潜在空间，分类器由此导出表型概率，变分推断恢复克隆型、协变量和细胞层次的表型分布。基于这些分布，TCRi计算克隆型熵、表型熵、表型流和克隆型与表型间的互信息（MI）。在四个真实世界数据集（167,118个CD8 T细胞）中，互信息成为治疗反应的稳健判别指标。研究表明，低治疗前归一化互信息（NMI）是免疫治疗应答的指标，而无应答者表现出更高的治疗前耦合。该框架为单细胞数据中TCR特异性变化的定量描述提供了原则性概率基础，可推广至其他基因型–表型关系，对免疫治疗、工程化T细胞和癌症疫苗等转化研究的统一比较具有重要意义。论文发表在《Nature Genetics》。

**关键技术方法**：研究人员采用分层贝叶斯模型对克隆型–表型关系进行概率建模，使用变分自编码器（VAE）嵌入单细胞基因表达数据，采用零膨胀负二项（ZINB）解码器生成GEX数据，使用VampPrior增强潜在空间灵活性，通过变分推断进行后验推断，模型以随机变分推断结合小批量训练和KL退火在Pyro中实现。研究使用四个已发表的配对单细胞TCR-seq和RNA-seq数据集：基底细胞癌（BSS）和鳞状细胞癌（SCC）抗PD-1治疗队列（22,452个CD8 T细胞，6,727个克隆型，14例患者）、肺癌抗PD-1治疗队列（23,024个CD8⁺ T细胞，8例患者）、非小细胞肺癌新辅助抗PD-1治疗队列（100,384个CD8⁺ T细胞，9例患者，含MANAFEST/ViraFEST验证的MANA和病毒抗原特异性）以及黑色素瘤ICB治疗队列（21,258个CD8 T细胞，22例供者）。

**研究结果**：

**克隆型与表型的分层贝叶斯模型**：研究人员从TRB CDR3氨基酸序列确定每个细胞的克隆型，表型标签初始来自先验注释或de novo方法。TCRi学习克隆型c与表型φ的联合概率分布p(c,φ)，将克隆型与表型关系视为概率推断问题而非确定性映射。通过半合成数据评估，TCRi对各种噪声源稳健；在表型分配错误存在时，TCRi比高斯混合模型基线更准确估计NMI，且估计误差随观察细胞数增加而降低。在真实数据子采样和多种噪声机制下评估，TCRi性能随工程噪声增加系统性下降，且TCRi可良好扩展至更大数据集。联合分布p(c,φ)使分析可限制于特定亚群，并提供计算信息论量的自然基础。条件分布p(c|φ)和p(φ|c)分别通过克隆型熵和表型熵表征；MI I(c,φ)和NMI(c,φ)用于比较克隆型数量严重不平衡的情况；表型流通过Kullback–Leibler（KL）散度量化样本间分布变化。

**抗PD-1治疗癌中的克隆型–表型耦合**：研究人员将TCRi应用于BSS或SCC患者抗PD-1 ICB的CD8 T细胞单细胞数据。潜在空间可视化显示先验与后验表型分配，1,680个CD8 naive T细胞被重新分配为记忆表型，差异表达基因富集测试显示负富集（归一化富集分数=?1.57），CCR7降低而TCF7升高，支持重新分类；含重新分配细胞的克隆显著大于保留naive状态分配的克隆。联合概率分布分析显示，无应答者中克隆型间表型多样性显著增加，应答者克隆型在两个时间点均较低熵。持续克隆（≥5细胞，治疗前后均存在）中，无应答者表型熵最高，应答者非持续克隆最低。表型流分析显示治疗前表型多样性与表型流和克隆持续相关，两者均与PD-1阻断应答相关。CD8效应细胞在应答者与无应答者间克隆型熵变化差异最大。ΔNMI后验分布在应答者中低于无应答者，随机克隆型标签的零模型显示应答者与无应答者分离显著降低。仅用治疗前数据重新训练模型，应答者与无应答者NMI差异仍显著（双侧Mann–Whitney U检验，P<0.0001）。应答者表现出一致较低的NMI，反映其表型状态最初与克隆型关联较松，而无应答者显示较高初始耦合且治疗后增加。

**抗PD-1治疗肺癌中的T细胞动力学**：研究人员分析8例肺癌患者（6例应答者，2例无应答者）治疗前后的23,024个CD8⁺ T细胞。先验与后验分配比较显示表型边界处细胞的细微但有意义的重新分类，CXCL13⁺ T细胞被重新分配为终末耗竭T细胞（Tex）。终末Tex表型在应答者与无应答者间克隆型熵变化差异最显著（Δ=0.16），应答者克隆多样性保持稳定而无应答者增加。利用VDJdb和NeoTCR数据库注释克隆型，识别43/654个推定的癌症相关TCR，发现无应答者中癌症相关克隆治疗前后熵变化大于背景克隆。与BCC/SCC数据集一致，应答者肺癌患者克隆型与表型间NMI低于无应答者，无应答者治疗后NMI增加而应答者降低；仅用治疗前数据TCRi仍可稳健判别应答（P<0.0001）。应答者特征为低熵免疫状态伴较少表型流，表现为低克隆型熵和克隆型与表型间低耦合。

**模型稳健性**：研究人员通过三项正交压力测试评估稳健性。第一，在保留患者水平协变量的情况下打乱克隆型标签，应答组信号消失，表明分离非仅由患者水平协变量导致。第二，系统细胞子采样下，TCRi在细胞保留分数范围内保持分离，表明分层池化即使在稀疏采样下也能恢复信号。第三，表型和克隆型标签独立损坏下，TCRi对表型标签噪声更稳健，而克隆型标签损坏导致分离和信号更急剧丧失。运行时间随细胞数和克隆型数近似线性扩展。

**抗PD-1治疗非小细胞肺癌中的新抗原特异性克隆型**：研究人员分析9例患者（4例应答者，5例无应答者）的100,384个CD8⁺ T细胞，其中MANA和病毒抗原通过MANAFEST/ViraFEST测定识别。MANA特异性肿瘤浸润淋巴细胞显示组织驻留记忆T细胞（TRM）样转录程序，细胞毒性激活不完全且IL-7反应性降低；无应答者特异性携带配体依赖性TCR信号较低且局限于TRM1（HOBIT^high定义）亚群的MANA克隆型。NMI分析显示，无应答者在每个抗原亚组（背景、病毒特异性、MANA特异性）中NMI均高于应答者（P<0.0001）。MANA特异性克隆型按应答 sharply 分裂：应答者MANA的NMI在所有亚组中最低，而无应答者MANA最高。MANA特异性克隆型高度集中于稳定低熵状态，主要映射至TRM表型；病毒克隆型TRM2表型概率高而MANA克隆型TRM1表型概率高。MANA特异性与病毒特异性克隆型在克隆型UMAP中占据不同区域，形成明显分离的簇；MANA样组TRM1概率显著高于病毒样组（平均概率0.84 vs 0.07，P<0.001）。In silico扰动分析显示，病毒特异性克隆型以细胞毒性组织驻留程序为特征（IL17A和CXCR6高重要性），MANA特异性克隆型以抗原呈递相关基因（B2M、CD74）、耗竭相关标记CXCL13和迁移相关基因TMSB4X高重要性为特征。基因重要性聚类为三个核心功能模块：TCR复合物与核心信号、终末功能与黏附、NK样细胞毒性；MANA特异性克隆型偏向终末与黏附及NK样细胞毒性顶点，TCR复合物与核心信号程序减弱。

**ICB治疗黑色素瘤患者的熵测量**：研究人员应用TCRi以CoNGA TCR簇作为克隆型标签，分析22例供者（14例ICB治疗黑色素瘤患者，其中8例发生结肠炎、6例未发生；8例健康对照）的21,258个CD8 T细胞。表型熵与CoNGA GEX变异在CoNGA簇上相关（Pearson R²=0.268，P=0.033），但NMI与CoNGA评分无显著关系。GEX变异在疾病组相对健康对照无升高（部分缓解vs健康P=0.61；进展性疾病vs健康P=0.99），而TCRi表型熵显示显著区分：部分缓解和进展性疾病患者表型熵均高于健康对照（P=0.01），与原始研究发现一致。TCRi表型熵定量重现疾病相关表型多样性并提供应答分层，即使在NMI本身无信息的情况下（ΔNMI=0.002，95% bootstrap CI ?0.005至0.009，P=0.27）。

**讨论与结论**：TCRi通过分层贝叶斯信息论框架构建克隆型与表型的联合概率分布。通过将表型分配视为概率推断问题，TCRi超越离散细胞类型标签，表示克隆型–表型关系的完整不确定性。克隆型熵和表型熵提供表型内克隆型多样性及反之的直观定量度量。利用四个配对单细胞TCR-seq和RNA-seq数据集，这些信息论量重现了原始分析报道的机制，包括治疗前反应性T细胞的存在和克隆复活现象，并解析了原始分析未报道的克隆型–表型关系，最显著的是低治疗前NMI与应答的关联。表型熵捕获适应性及肿瘤反应性T细胞应答；与克隆型熵配对时，TCRi比单独克隆性度量更敏感地识别表型间库多样性差异；通过KL散度量化的表型流描述治疗前后克隆表型的稳定性，突出指示应答的转变。更广泛地，互信息成为克隆型–表型依赖的统计信息度量：低治疗前NMI是免疫治疗应答的指标，而无应答者表现出更高的治疗前通信。该方法可推广至其他基因型–表型关系。TCRi为单细胞数据中TCR特异性变化的定量描述提供了原则性概率基础，其独特性在于将这些度量组合在统一信息论框架中，明确建模患者和克隆型的嵌套结构。该框架可扩展至大型良好注释数据集，以评估与特定克隆型相关的转录程序变化的治疗。这些定量度量的可重复性对于单细胞水平研究患者对免疫治疗的生物学应答至关重要，尤其在免疫治疗、靶向免疫治疗（包括工程化T细胞和癌症疫苗）及联合治疗不断扩展的背景下。通过为配对单细胞数据创建一致的信息论框架，TCRi可赋能以T细胞参与性质为关键作用机制的转化研究的统一比较。