《Plant Diversity》：The first telomere-to-telomere (T2T) genome assembly provides new insights into the endangerment mechanism and conservation practices of Ostrya rehderiana
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全球生物多样性丧失正在加速，其主要驱动因素为人类活动与气候变化，并可能对生态系统功能及进一步物种灭绝产生级联效应。珍稀濒危植物尤其易受栖息地丧失与片段化影响。中国植物多样性极为丰富，但快速的土地利用变化与社会经济发展已日益导致许多珍稀濒危物种栖息地缩减与片段化
全球生物多样性丧失正在加速，其主要驱动因素为人类活动与气候变化，并可能对生态系统功能及进一步物种灭绝产生级联效应。珍稀濒危植物尤其易受栖息地丧失与片段化影响。中国植物多样性极为丰富，但快速的土地利用变化与社会经济发展已日益导致许多珍稀濒危物种栖息地缩减与片段化。除种群数量下降外，这些物种还可能经历基因组侵蚀，其特征为有效种群规模缩减后遗传多样性丧失与有害突变累积。此类基因组变化可损害个体适合度、适应能力与长期进化存续力，凸显了理解种群历史与全基因组变异对有效保护的重要性。染色体水平与端粒到端粒（T2T）基因组组装的近期进展，为解析基因组结构、量化遗传变异与重建进化历史创造了前所未有的机遇，从而为理解物种衰退背后的基因组过程提供了新见解。然而，中国最受威胁植物的基因组资源仍十分匮乏。根据2021年版《国家重点保护野生植物名录》，中国有136种被列为国家一级保护野生植物。其中，20种已有公开可用的基因组组装，17种具有高质量染色体水平基因组，大多数受威胁物种仍缺乏可比的基因组资源。这一差距限制了识别脆弱性基因组特征、评估适应潜力并将基因组信息转化为有效保护策略的能力。Ostrya rehderiana 是一种极小种群野生植物（PSESP），在IUCN红色名录中被列为极危（CR）。1927年首次在野外发现时，其自然种群中尚存数十个个体。随后的自然灾害与人为林地开发逐渐使其种群规模缩减，至今仅存5株野生个体。基于分子标记的先前研究证实，其野生种群表现出极低的核苷酸多样性并面临近交衰退风险。Ostrya 属隶属桦木科（Betulaceae），该科还包含 Betula、Alnus、Corylus、Carpinus 与 Ostryopsis 五个其他属，其中许多重要树种广泛分布于北半球温带地区。目前，桦木科6个属中已有18个物种的染色体水平基因组发表。对于 O. rehderiana，已有基于Illumina HiSeq 2500平台全基因组鸟枪法测序的支架水平基因组组装，其contig N50为21.96 kb，包含27,831个蛋白编码基因。有害隐性变异的清除与近交衰退的逐渐降低可能共同缓解了灭绝并促成了 O. rehderiana 未来可能的存续。受基因组质量限制，尚未开展比较分析以进一步探究 O. rehderiana 或桦木科的基因组演化。本研究结合PacBio HiFi、Oxford Nanopore长读长测序（ONT）、Hi-C与Illumina短读长测序技术，生成了 O. rehderiana 首个端粒到端粒（T2T）基因组组装，N50为40.62 Mb，共31,097个蛋白编码基因。利用该高质量T2T组装，研究人员进一步与桦木科其他物种基因组开展比较基因组分析，以探究基因家族演化，并发现 O. rehderiana 抗性基因的扩张。
研究背景与问题
全球生物多样性丧失正在加速，主要驱动因素为人类活动与气候变化，并可能对生态系统功能及进一步物种灭绝产生级联效应。珍稀濒危植物尤其易受栖息地丧失与片段化影响。中国植物多样性极为丰富，但快速的土地利用变化与社会经济发展已日益导致许多珍稀濒危物种栖息地缩减与片段化。除种群数量下降外，这些物种还可能经历基因组侵蚀（genomic erosion），其特征为有效种群规模（effective population size）缩减后遗传多样性丧失与有害突变累积。此类基因组变化可损害个体适合度、适应能力与长期进化存续力，凸显了理解种群历史与全基因组变异对有效保护的重要性。染色体水平与端粒到端粒（telomere-to-telomere，T2T）基因组组装的近期进展，为解析基因组结构、量化遗传变异与重建进化历史创造了前所未有的机遇，从而为理解物种衰退背后的基因组过程提供了新见解。然而，中国最受威胁植物的基因组资源仍十分匮乏。根据2021年版《国家重点保护野生植物名录》，中国有136种被列为国家一级保护野生植物，其中仅20种已有公开可用的基因组组装，17种具有高质量染色体水平基因组，大多数受威胁物种仍缺乏可比的基因组资源。这一差距限制了识别脆弱性基因组特征、评估适应潜力并将基因组信息转化为有效保护策略的能力。
Ostrya rehderiana 是一种极小种群野生植物（plant species with extremely small populations，PSESP），在IUCN红色名录中被列为极危（critically endangered，CR）。1927年首次在野外发现时，其自然种群中尚存数十个个体；随后的自然灾害与人为林地开发逐渐使其种群规模缩减，至今仅存5株野生个体。基于分子标记的先前研究证实，其野生种群表现出极低的核苷酸多样性并面临近交衰退（inbreeding depression）风险。Ostrya 属隶属桦木科（Betulaceae），该科还包含 Betula、Alnus、Corylus、Carpinus 与 Ostryopsis 五个其他属，其中许多重要树种广泛分布于北半球温带地区。目前，桦木科6个属中已有18个物种的染色体水平基因组发表。对于 O. rehderiana，已有基于Illumina HiSeq 2500平台全基因组鸟枪法测序的支架水平基因组组装，其contig N50为21.96 kb，包含27,831个蛋白编码基因。有害隐性变异的清除与近交衰退的逐渐降低可能共同缓解了灭绝并促成了 O. rehderiana 未来可能的存续。受基因组质量限制，尚未开展比较分析以进一步探究 O. rehderiana 或桦木科的基因组演化。为此，研究人员结合PacBio HiFi、Oxford Nanopore长读长测序（ONT）、Hi-C与Illumina短读长测序技术，生成了 O. rehderiana 首个T2T基因组组装，N50为40.62 Mb，共注释31,097个蛋白编码基因；并利用该高质量组装与桦木科其他物种开展比较基因组分析，探究基因家族演化，发现 O. rehderiana 抗性基因的扩张。
主要技术方法
研究人员采集5株野生 O. rehderiana 个体之一（古树编号0185310000101，浙江天目山，30°19′ N，119°27′ E）的新鲜叶片用于基因组测序，并自同一植株采集幼叶、芽、雄花、茎、未成熟种子与成熟种子用于RNA-seq转录组测序以辅助基因注释。基因组调查使用21.50 Gb Illumina短读长，17-mer频率分析采用Jellyfish v.2.1.4，基因组大小经GenomeScope2估计为347.95 Mb。De novo 组装采用Hifiasm v.0.19.8（默认参数）基于51.3 Gb PacBio HiFi长读长完成；contig经82.4 Gb ONT长读长与21.50 Gb Illumina短读长校正，并用purge_haplotigs v.1.1.3去除冗余单倍型；随后利用40.8 Gb Hi-C读长经YaHS v1.2a.1排序、定向并锚定至8条假染色体。重复序列库经RepeatModeler构建，并结合Repbase植物重复数据库进行全基因组重复元件注释。蛋白编码基因注释整合转录组证据、近缘物种同源蛋白比对（O. rehderiana、Ostrya multinervis、Populus trichocarpa 与 Arabidopsis thaliana）及 de novo 预测三种策略。组装与注释完整性以BUSCO v.3评估。比较基因组分析选取9个桦木科物种，以 Quercus variabilis 与 Populus trichocarpa 为外类群，基于单拷贝直系同源基因以最大似然法构建系统发育树，并用3个化石记录重新校准物种分化时间。
研究结果
染色体水平基因组组装与分析：研究人员获得 O. rehderiana 终组装基因组大小353.42 Mb，contig N50为40.62 Mb，8条无间隙染色体两端均检测到端粒特征重复序列；BUSCO评估显示组装完整性达98.8%。重复序列占组装基因组的48.86%，其中LTR反转录转座子占全基因组长度的19.02%，DNA转座子（含Helitron与TIR元件）合计占29.84%；绝大多数转座元件序列分布于基因间区与染色体着丝粒区，蛋白编码基因内检测到的重复序列插入很少。共注释31,097个高置信度蛋白编码基因，显著多于2018年草图基因组的27,831个；平均转录本长度3,956.73 bp，平均CDS长度1,157.32 bp，每基因平均外显子数4.91；注释基因集BUSCO完整性达98.40%，30,195个基因至少获得一个数据源（NR、Swiss-Prot、KEGG、GO、PFAM与InterPro）注释。
系统发育与分化时间：11个物种共鉴定9,940个共享直系同源基因家族，其中1,893个为单拷贝直系同源组。基于共线性的比较分析显示，Betula platyphylla、O. rehderiana 与 Ostryopsis davidiana 分化后存在丰富的染色体结构重排。系统发育与分化时间分析表明，Alnus 与 Betula 为桦木科最早分化的两个属，分化时间约45.8 Ma；Ostrya 与 Carpinus 分化相对较近，约11.5 Ma；O. rehderiana 与 O. multinervis 的分化时间估计为6.56 Ma，略早于先前估计的6.06 Ma。全基因组复制（whole-genome duplication，WGD）分析表明，O. rehderiana 经历了核心真双子叶植物共享的古老全基因组三倍化事件（γ事件），无证据支持存在 O. rehderiana 特异的WGD事件。
基因家族演化与抗性基因扩张：O. rehderiana 中30,187个基因（占全部注释基因的97.1%）聚为21,852个基因家族，其中797个基因归属258个物种特异基因家族；鉴定出605个扩张基因家族与627个收缩基因家族。扩张基因家族在525个GO条目与49个KEGG通路中获得功能注释；显著性最高的生物学过程主要富集于三类GO类别：其一为植物抗性，包括对外部刺激的响应、对过氧化氢/一氧化氮的细胞响应、对细菌/卵菌的防御响应，尤其是茉莉酸与乙烯依赖的系统抗性；其二为信号通路，包括红光或远红光信号通路、钙介导信号通路及生长素介导信号通路的负调控；其三为植物发育过程，包括花发育、雄蕊发育、种子成熟与种子休眠的调控。这表明 O. rehderiana 当前极小种群规模可能并非源于环境胁迫相关抗性基因或冰期后气候变化相关抗性基因的丧失，而是源于历史种群规模收缩或栖息地片段化后种群扩散与扩张的失败；同时提示 O. rehderiana 基于基因组数据可能适应不同地理区域或未来气候变化。
迁地保护试验：研究人员在全国9个试验点建立迁地保护试验，存活率为2%至84%，其中1980年代植于昆明的一株个体已开花。同时，研究人员在不同林冠郁闭度（0.4、0.6与0.8）与海拔（500 m与900 m）下栽植幼苗，平均存活率为57%。幼苗在这些对比地点成功存活，验证了 O. rehderiana 具有跨越地理位置、海拔与郁闭度梯度的广泛环境适应性。
结论与讨论
研究人员在本研究中组装了极危物种 O. rehderiana 包含8条无间隙染色体的T2T水平基因组。通过探究基因家族演化历史，研究人员提出 O. rehderiana 当前的濒危状态可能源于第四纪冰期气候变化导致的严重种群规模收缩。与此同时，至少在遗传水平上维持了较高的抗逆潜力与环境适应潜力，并进一步经迁地保护试验验证。然而，完整评估仍需基于种群遗传数据对遗传多样性与有害突变分布开展进一步分析。此外，本研究产生的基因组资源将有助于 O. rehderiana 保护策略的制定与迁地保护实践。
