《Plant Physiology and Biochemistry》：The SbNAC Gene Family in Sorghum: Genomic Characterization, Functional Diversity, and Roles in Abiotic Stress Responses
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高粱（Sorghum bicolor Moench）是半干旱和干旱地区的重要谷类作物，干旱、高温、盐渍和土壤条件限制其建植、生长、生殖和产量。其相对耐水性使高粱对粮食安全具有重要意义，并成为研究C4禾本科植物胁迫适应的有用模式，但这种韧性并不意味着高粱对胁迫免
高粱（Sorghum bicolor Moench）是半干旱和干旱地区的重要谷类作物，干旱、高温、盐渍和土壤条件限制其建植、生长、生殖和产量。其相对耐水性使高粱对粮食安全具有重要意义，并成为研究C4禾本科植物胁迫适应的有用模式，但这种韧性并不意味着高粱对胁迫免疫，也不意味着其响应机制已被完全理解。胁迫效应因基因型、组织、发育阶段、暴露时间和强度而异。NAC转录因子家族因首次鉴定到保守NAC结构域的三个蛋白组（NAM、ATAF和CUC）而得名。高粱中的NAC家族成员被称为SbNAC基因。先前的 Sicherheit 高粱研究已鉴定和分类了NAC基因，分析了其基因组结构，预测了调控元件，并检测了其对非生物胁迫的表达响应。全基因组调查已报道了131至145个SbNAC基因，差异部分归因于基因组注释、基因模型和鉴定标准。一项独立研究检测了三种高粱基因型在灌浆后干旱下三个采样时间的NAC家族基因表达，报道了基因、基因型和采样时间之间的变异。此类研究产生了许多候选基因；鉴定SbNAC序列、预测其启动子元件或检测胁迫响应性表达本身并不能证明该基因导致了所测定的胁迫响应。SbNAC文献的一个关键特征是候选基因鉴定与功能证据之间的区分。多项研究检测了基因对脱水、盐渍、冷和脱落酸等处理的表达响应；例如，高粱盐胁迫转录组学已报道了NAC家族表达的变化。较少的SbNAC基因在高粱中进行了功能测试。已有报道SbNAC2对脱水、盐和冷害胁迫响应；在高粱幼苗中沉默它降低了耐旱性，并与胁迫响应基因SbAP37的抑制相关。在单独实验中，SbNAC9的过表达和沉默改变了干旱相关性状，包括光合性能、根系发育和ROS清除。相比之下，SbNAC56过表达与萌发期间对脱落酸、氯化钠和甘露醇的敏感性增加相关。总之，这些发现表明SbNAC效应是基因和情境依赖的，并不一定在整个家族中都是有益的。表达结果在其实验情境之外也具有有限的普适性。许多研究集中于单一胁迫或少量基因型和地点，而田间种植的高粱可能在不同发育阶段遇到胁迫或同时经历多种胁迫。田间转录组时间序列已显示不同高粱基因型和组织中胁迫暴露期间表达模式的变化。热-旱联合实验也鉴定了共有和胁迫组合特异性的转录响应。这些发现警示不要将单一处理或采样时间的结果外推到其他胁迫或田间条件。转录诱导表明响应性，但本身并不能证明该基因增加胁迫耐受性；需要功能测试来评估这种关系。转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究通过记录基因表达、蛋白质丰度和代谢物水平的变化，扩展了对高粱胁迫响应的理解；整合研究有助于将SbNAC候选基因定位在胁迫相关通路中。例如，加权基因共表达网络分析可以优先考虑在样本间共变的基因，但仅共表达并不能证明候选基因是调控因子或主要调控因子。同样，蛋白质或代谢物丰度的变化不能证明与特定SbNAC的关系，除非实验操纵该基因并测试该关系。挑战不仅在于鉴定候选基因和网络连接，还在于区分可重复的模式与因果机制。在本综述中，研究人员批判性地总结了SbNAC基因家族结构 and 进化、胁迫响应性表达、功能表征和已提出的调控网络的研究。研究人员比较了全基因组、转录组学和多组学方法；区分了基于表达的候选基因与实验功能证据；并将来自高粱的证据与其他植物物种的发现分开考虑。研究人员特别关注SbNAC2和SbNAC9的功能证据、SbNAC56响应的情境依赖性，以及所提出的网络关系在基因型、发育阶段和胁迫条件之间有限验证的问题。最后，研究人员确定了阐明单个SbNAC基因在高粱胁迫响应中的作用并评估其作物改良潜力的研究优先事项。
**研究背景与问题**：高粱（Sorghum bicolor Moench）是半干旱和干旱地区的重要谷类作物，干旱、高温、盐渍和土壤条件限制其建植、生长、生殖和产量。其相对耐水性使高粱对粮食安全具有重要意义，并成为研究C4禾本科植物胁迫适应的有用模式，但这种韧性并不意味着高粱对胁迫免疫，也不意味着其响应机制已被完全理解。胁迫效应因基因型、组织、发育阶段、暴露时间和强度而异。NAC转录因子家族因首次鉴定到保守NAC结构域的三个蛋白组（NAM、ATAF和CUC）而得名，高粱中的NAC家族成员被称为SbNAC基因。全基因组调查已报道了131至145个SbNAC基因，差异部分归因于基因组注释、基因模型和鉴定标准。SbNAC文献的一个关键特征是候选基因鉴定与功能证据之间的区分：鉴定SbNAC序列、预测启动子元件或检测胁迫响应性表达本身并不能证明该基因导致所测定的胁迫响应。较少的SbNAC基因在高粱中进行了功能测试，且表达结果在其实验情境之外具有有限的普适性。因此，研究人员开展本综述，旨在批判性地总结SbNAC基因家族结构、进化、胁迫响应性表达、功能表征和已提出的调控网络，区分基于表达的候选基因与实验功能证据，并确定研究优先事项。
**研究结论与意义**：高粱NAC家族包含功能多样的调控因子，其对非生物胁迫响应的贡献在部分成员中已确立，但在家族大部分成员中仍未解决。全基因组表征和表达谱分析鉴定了众多候选基因，而原生功能分析为特定调控机制提供了更强证据。SbNAC2激活SbAP37并贡献于幼苗耐旱性，SbNAC9将干旱性能与抗氧化活性和脱落酸生物合成的下游调控联系起来。SbNAC56过表达株系萌发敏感性增加进一步表明胁迫响应性并不意味着统一的保护功能。这些发现支持基因特异性作用而非所有SbNAC蛋白共享的共同耐受机制。主要挑战在于将已验证的分子功能与有利等位变异和持续生殖性能联系起来。原生遗传操作、直接靶标分析和协调的分子与生理测量应解决这些联系，而田间评估必须确定其在高粱背景和环境中的相关性。SbNAC基因因此为研究胁迫适应提供了机制基础，但其在作物改良中的部署取决于证明可重复的农艺效益。
**关键技术方法**：本综述为批判性文献综述，未涉及原始实验操作。所综述研究主要采用的关键技术方法包括：全基因组鉴定（隐马尔可夫模型搜索或序列相似性搜索及保守NAC结构域确认）、系统发育分析、启动子顺式调控元件预测、表达谱分析（脱水、盐渍、冷和ABA处理下的转录组学）、病毒诱导基因沉默（VIGS）、过表达转基因功能验证、酵母单杂交或启动子结合实验（用于验证SbNAC9对SbC5YQ75和SbNCED3的直接激活）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、多组学整合（转录组学、蛋白质组学、代谢组学）、关联作图（590份西非种质在4种水分 regime 和10个田间环境下的分析）、基因组预测（多性状模型）、CRISPR/Cas9基因编辑（结合WUSCHEL2形态发生调控因子提高转化和编辑频率）。样本队列来源为西非高粱种质资源（590份材料）。
**研究结果**：
**2. SbNAC基因家族：结构、进化与基因组组织**：通过序列分析、表达谱分析和功能表征，研究人员总结了SbNAC基因家族的染色体分布、基因结构、保守基序和系统发育关系。全基因组调查鉴定了131至145个SbNAC基因，分布于全部10条染色体，大多数包含3个外显子和2个内含子，蛋白质分为16个系统发育组。NAC蛋白具有保守的N端NAC结构域（分为A–E五个亚结构域，A、C、D相对保守，负责结构完整性、蛋白互作和DNA结合；B和E较多变）和可变的C端区域（常参与转录激活或抑制）。启动子分析鉴定了与脱水、盐渍和ABA响应相关的推定顺式调控元件。研究还预测了microRNA靶位点、5′非翻译区内部核糖体进入位点和上游开放阅读框，但这些特征的体内活性尚未通过实验证实。
**3. SbNAC基因在非生物胁迫下的表达动态**：通过转录组学分析，研究人员发现高粱干旱响应性表达具有组织、基因型和处理时间依赖性。田间实验对两种基因型在开花前和开花后干旱下生成近400个转录组，叶片和根系的响应时间进程不同，基因型在光合作用和ROS清除相关通路中存在差异。一项研究鉴定了131个SbNAC基因和183个编码蛋白，其中13个蛋白归入胁迫相关NAC亚组；三种基因型在灌浆后干旱下三个采样时间的表达分析支持鉴定生殖期干旱响应候选基因。功能证据方面，SbNAC9沉默降低干旱胁迫下高粱幼苗的耐旱性，而过表达增强耐旱性；过表达植株还表现出更高的叶绿素含量和PSII光化学效率、更强的根系和更大的ROS清除能力；启动子结合和激活实验鉴定推定过氧化物酶基因SbC5YQ75和ABA生物合成基因SbNCED3为SbNAC9下游靶标。SbNAC2通过启动子结合直接激活SbAP37。盐渍研究中，耐盐基因型SSG 59-3和盐敏感基因型PC-5的比较分析鉴定了包括NAC相关转录本在内的盐响应差异表达基因。SbNAC56过表达在萌发期间增加对ABA、NaCl和D-甘露醇的敏感性。多组学方面，田间转录组学解析了组织特异性和时间性干旱响应，比较根系蛋白质组学鉴定了不同干旱响应品种的共同和基因型特异性蛋白响应，代谢组学研究鉴定了PEG诱导渗透胁迫下可溶性糖、氨基酸及其生物合成途径基因表达的变化。
**4. 非生物胁迫耐受中以SbNAC为中心的调控网络**：通过功能验证和互作实验，研究人员总结了特定转录因子与下游基因激活、激素生物合成和抗氧化响应之间的关联。SbNAC9激活ABA生物合成和ROS清除相关基因；SbMPK3与SbNAC074互作并磷酸化后者，SbNAC074过表达增强转基因烟草耐盐性。SbNAC2–SbAP37互作涉及两个转录因子，病毒诱导的SbNAC2沉默降低高粱幼苗耐旱性，SbNAC2结合SbAP37启动子并激活其表达。SbNAC9通过推定过氧化物酶基因SbC5YQ75和ABA生物合成相关基因SbNCED3连接两个干旱相关过程；沉默SbC5YQ75损害耐旱性，沉默SbNCED3降低高粱幼苗ABA含量。ABA相关证据表明SbNAC蛋白对激素不显示统一响应：SbNAC9激活SbNCED3，而ABA处理也改变NAC表达，表明双向调控连接但本身不建立反馈环路；SbNAC56过表达株系显示对ABA、盐和甘露醇的更大敏感性。蛋白互作网络中，SbMPK3–SbNAC074互作提示磷酸化可能连接上游信号与转录因子活性；水稻中OsMAPK3磷酸化OsNAC29促进其稳定性和下游基因激活，为更完整的比较示例。系统生物学和网络建模方面，共表达网络表明协同转录，但统计关系不能转化为调控机制；当前SbNAC网络描述仍不完整，缺乏单个SbNAC机制与整株性能之间的联系。
**5. 高粱NAC基因的功能表征**：通过原生遗传操作和异源表达，研究人员发现选定NAC转录因子在干旱响应、抗氧化调控和激素相关过程中具有不同作用。SbNAC2表达受PEG模拟脱水、盐渍和冷害诱导，病毒诱导沉默降低高粱幼苗耐旱性，启动子结合实验支持SbNAC2直接激活SbAP37。SbNAC9过表达增加高粱幼苗抗旱性、叶绿素含量、PSII光化学效率、根系发育和ROS清除，沉默产生相反干旱响应；两个下游靶标SbC5YQ75和SbNCED3的沉默分别影响耐旱性和ABA水平。SbNAC56过表达株系在萌发期间显示对ABA、NaCl和D-甘露醇的敏感性增加，说明胁迫响应性表达本身不足以建立正向耐受作用。SbMPK3与SbNAC074互作并磷酸化后者，SbNAC074过表达增强转基因烟草耐盐性，但烟草表型本身不能证明高粱植株耐盐性改善。已表征的SbNAC基因尽管属于结构相关家族，但显示功能多样性：SbNAC2激活下游转录因子，SbNAC9与抗氧化活性和ABA生物合成相关，SbNAC074参与激酶相关调控互作，SbNAC56提供萌发期胁迫敏感性的对比表型。
**6. 非生物胁迫改良的转化应用**：通过关联作图、基因组预测和转化技术，研究人员总结了SbNAC转录因子分子功能已表征但农艺价值仍缺乏充分记录。对590份西非材料在4种水分 regime 和10个田间环境4年评估，鉴定了产量组分与干旱适应之间的关联；持绿区域与干旱适应广泛相关，但区域关联不能建立因果基因。Stg1–Stg4数量性状位点在近等基因系中的评估将这些位点与冠层性状、水分利用变化和花后干旱下籽粒产量增加联系起来。多性状基因组预测模型相比单性状模型改善高粱籽粒产量预测，报告增益高达16%。CRISPR/Cas9结合WUSCHEL2使基因敲除频率相比无WUSCHEL2转化提高高达6.8倍。启动子编辑是改善SbNAC功能的潜在但尚未确立的方法；顺式调控编辑已在高粱中展示表达调谐，但尚未在SbNAC位点。数据引导育种方面，SbNAC信息预测框架应证明相对于适当基线在目标育种群体中的可测量益处。
**讨论与结论翻译**：高粱NAC家族包含功能多样的调控因子，其对非生物胁迫响应的贡献在部分成员中已确立，但在家族大部分成员中仍未解决。全基因组表征和表达谱分析鉴定了众多候选基因，而原生功能分析为特定调控机制提供了更强证据。SbNAC2激活SbAP37并贡献于幼苗耐旱性，SbNAC9将干旱性能与抗氧化活性和脱落酸生物合成的下游调控联系起来。SbNAC56过表达株系萌发敏感性增加进一步表明胁迫响应性并不意味着统一的保护功能。这些发现支持基因特异性作用而非所有SbNAC蛋白共享的共同耐受机制。主要挑战在于将已验证的分子功能与有利等位变异和持续生殖性能联系起来。原生遗传操作、直接靶标分析和协调的分子与生理测量应解决这些联系，而田间评估必须确定其在高粱背景和环境中的相关性。SbNAC基因因此为研究胁迫适应提供了机制基础，但其在作物改良中的部署取决于证明可重复的农艺效益，超越表达变化和受控环境表型。
