《Veterinary Oncology》：Identification of somatic mutations in lymphomas of Bernese Mountain dogs
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背景：犬淋巴瘤与人类对应疾病高度相似，因此可作为比较与转化研究的转化动物模型。伯恩山犬（BMDs）在历史上易患淋巴瘤，然而该品种的体细胞突变谱尚未被界定。方法：研究人员分析了来自密歇根州立大学伯恩山犬DNA与组织资源库的27份BMD淋巴瘤样本，使用靶向基因面板
背景：犬淋巴瘤与人类对应疾病高度相似，因此可作为比较与转化研究的转化动物模型。伯恩山犬（BMDs）在历史上易患淋巴瘤，然而该品种的体细胞突变谱尚未被界定。方法：研究人员分析了来自密歇根州立大学伯恩山犬DNA与组织资源库的27份BMD淋巴瘤样本，使用靶向基因面板检测了499个癌症相关基因中的突变。结果：在96.3%的病例中检测到体细胞突变，最常受影响的是TRAF3（25.9%）、TP53、EP300和MYC（各22%）以及MAP3K14（19%）。在66%的样本中鉴定出拷贝数变异，KMT2C、PIK3R1、TP53、MTAP、PTEN、MET、NRG1、PTPN11、SCRN1和SETD2存在反复性改变。结论：研究人员报告了BMD淋巴瘤中与其他品种共享的遗传谱，以及品种特异性改变，如EP300基因。这些发现可能有助于未来的治疗策略和该品种的新型预后生物标志物，对比较肿瘤学和转化研究具有潜在意义。
研究背景方面，犬高级别多中心淋巴瘤是一种临床侵袭性疾病，与人类高级别非霍奇金淋巴瘤相当，是人类和兽医肿瘤学家共同面临的难题。犬和人类患者均接受类似的多药方案作为一线治疗，但由于内在或获得性耐药，人类患者中30%–40%治疗失败，而在几乎所有犬患者中治疗失败。由于相似的肿瘤生物学、发病率和生物学行为，犬淋巴瘤日益受到关注，作为自然疾病的动物模型以帮助充分阐明人类非霍奇金淋巴瘤的病因学。犬的选择性育种导致了显著的形态学变异和各品种对多种疾病的独特易感性。每个品种内的遗传同质性可被视为人类遗传易感性相关信息的来源。伯恩山犬（BMD）被确定为八种易患淋巴瘤的品种之一，特别是中心母细胞性淋巴瘤，即弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的一种形态学亚分类。除淋巴瘤外，BMD还公认易患组织细胞肉瘤（HS），这是一种高度恶性且与品种高度相关的肿瘤。系谱分析和临床研究表明，超过40%受HS影响的犬会发展为额外的癌症，其中淋巴瘤报告为最常见的继发性癌症之一（约3.1%），高于一般犬群中的报告患病率（每10万只犬13–24例；0.02%）。这些观察结果提示存在潜在的遗传因素使BMD易患肿瘤性疾病。研究人员假设参与HS中树突状细胞恶性转化的基因也可能促进其他造血细胞系的肿瘤性转化，或者癌症易感变异可能在该品种中普遍存在。尽管BMD中癌症的遗传易感性仍未完全了解，但FANCG基因编码区的一个多态性——位于MTAP/CDKN2A位点附近且处于蛋白质的保守区域——最初在患有组织细胞肉瘤的BMD中被鉴定，似乎为该品种所独有并进一步影响DNA修复机制。犬品种已被证明与犬淋巴瘤风险相关，某些品种表现出显著增加的风险。尽管BMD是淋巴瘤最常受影响的品种之一，但该品种淋巴瘤的遗传景观尚未被广泛研究。特定品种中相关遗传变异的表征很重要，因为某些可能在某些品种中更常发生的变异已被证明具有预后意义；例如，TP53突变与犬淋巴瘤较差的预后相关。研究人员通过下一代测序分析研究了该品种中与淋巴瘤相关的体细胞突变的存在。
研究人员开展了以下研究：所有生物样本来源于密歇根州立大学的Berner-Garde组织资源库。样本为新鲜冷冻肿瘤标本，来自诊断性手术切除肿瘤时的剩余组织，或在尸检时采集，来自不同动物，由兽医从业者/犬主提交至资源库并签署知情同意书。所有纳入研究的病例均基于委员会认证的兽医病理学家进行的组织病理学评估确认淋巴瘤诊断。由于研究的回顾性性质和从资源库获取样本，关于组织解剖来源、组织学亚型、肿瘤起源和任何先前治疗的信息不可用。这些标本的使用经密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号AUF 08/15–127-00。DNA样本使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒（69504, Qiagen）分离，并使用Qubit 2.0（Thermo Fisher Scientific）定量。提取的DNA用于文库制备，使用CanCan Diagnostics专有文库富集试剂盒-K9-TMB/MSI，富集499个基因约1.74 MB。这是一种基于杂交的捕获，富集所选基因的所有编码区。文库使用Qubit定量并使用Tapestation 4200（Agilent Technologies）分析质量。所有样本使用Illumina NextSeq 2000平台以配对末端（PE）测序模式、100-bp reads测序至平均目标原始深度至少500x。数据随后使用定制的专有CanCan Diagnostics分析流程并利用GATK最佳实践进行分析。原始reads被修剪，低质量碱基在比对前被去除（fastp v0.23.4）。reads随后使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA-MEM v0.7.18）比对至CanFam3.1参考基因组。PCR重复使用Picard（v2.23.8）标记，比对质量分数低于30的reads被排除。比对后的reads使用基因组分析工具包（GATK v4）进一步处理。Mutect2（GATK v4）用于识别单核苷酸变异（SNVs）和小插入缺失（INDELs）。获得的变异调用使用GATK最佳实践过滤，以保留具有高置信度、足够read深度和碱基质量的体细胞变异。GATK流程输出的VCF被移植到vcf2maf.pl软件包，该软件利用Ensembl变异效应预测器（v113）用已知犬变异数据库注释变异。除注释变异类型和位置外，该软件整合了SIFT算法，通过评估每个突变的进化保守程度来预测氨基酸替换是否有害。此外，记录在dbSNP数据库中的已知犬多态性也同样被注释。体细胞变异从Mutation Annotation Format（MAF）文件中调用，并使用R中的maftools包处理。标记为测序或技术伪影的变异如"panel_of_normals"、"weak_evidence"或"haplotype"被从进一步分析中丢弃。基于变异等位基因频率（VAF）应用额外过滤，保留VAF在3%–95%之间的变异以排除潜在的测序噪声和可能的种系调用。由健康犬样本（n=77；buffy coat DNA）组成的正常面板（PoN）用于辅助变异过滤。这些样本使用与肿瘤样本相同的测序流程处理，包括相同的仪器、分析条件、靶向富集面板和可比的测序深度。这种方法使得在体细胞变异调用过程中能够识别和去除反复性技术伪影和非肿瘤变异。此外，针对突变数据库进行种系过滤（dbSNP, Dog 10k project）。注释为"novel"的变异被保留。过滤后的突变集随后使用oncoplot可视化，显示27个肿瘤样本中前30个最频繁突变的基因。拷贝数变异（CNVs）按照GATK肿瘤仅CNV流程最佳实践识别。CollectReadCounts函数用于收集捕获面板目标区间（499基因/1.74 Mb）的read计数。计数随后通过DenoiseReadCounts针对来自145只健康犬的正常面板进行标准化和去噪。CollectAllelicCounts用于去除捕获和GC相关偏差，并捕获常见双等位基因犬SNP数据集（Dog10K）的等位基因分数。去噪的log?拷贝比率和等位基因分数使用ModelSegments联合分割，片段使用CallCopyRatioSegments调用。由于该检测仅限于捕获的外显子，拷贝数推断以基因水平报告：当基因被平均log?拷贝比率>0.9或
研究结果方面，样本概览和体细胞突变景观：共纳入27份BMD淋巴瘤组织样本进行分析。测序揭示96.3%的分析样本（26/27份样本）存在体细胞突变。每个样本中位6个变异通过所有质量过滤器，范围为每样本1至22个变异。所有样本均与综合正常面板和种系资源进行比较。最频繁突变基因的分析鉴定了BMD淋巴瘤发病机制中的几个潜在关键突变。TRAF3成为最频繁突变的基因，在25.9%的样本中检测到突变。TRAF3突变类型多样，包括错义突变和移码突变。其他高度突变的基因包括TP53、EP300和MYC，各在22%的样本中改变。TP53和MYC基因中鉴定的突变均归类为错义突变。MAP3K14也频繁突变（19%），突变变异包括错义、剪接位点、框内缺失和移码插入。其他值得注意的突变频率感兴趣的基因包括CSMD3、ARID1A、LRP2、LRP1B和CIC，突变率在11%至19%之间。基因间突变模式：oncoplot可视化（图1）清晰呈现了样本间的突变分布，频繁突变基因中出现明显模式。TP53、MYC和CSMD3显示错义突变的明显优势。TRAF3、MYC和TP53分析：鉴于其高突变率和功能相关性，TRAF3、MYC和TP53使用棒棒糖图详细分析以可视化蛋白质序列上的突变热点。TRAF3基因是队列中最频繁突变的基因，体细胞突变率为25.9%（图2）。突变分布在关键结构域，如MATH_TRAF3和RING，这些结构域对TRAF3在信号通路包括NF-κB信号中的调节功能至关重要。在TRAF3中观察到多样的突变类型谱，包括错义、移码缺失和插入，以及较少见的无义突变、剪接位点和框内缺失。TP53基因表现出22.2%的体细胞突变率（图2），突变分布在整个基因中。涉及DNA结合（P53）和寡聚化（P53_tetramer）的关键功能结构域受到影响。所有突变均归类为错义变异。同样，MYC基因显示22.2%的体细胞突变率（图2）。突变主要影响Myc_N结构域，归类为错义突变。总体而言，TRAF3成为本研究中突变最多的基因，与TP53和MYC相比具有更广泛的突变类型谱。这些发现突显TRAF3作为肿瘤发展和进展中的潜在关键角色。拷贝数变异（CNVs）：对27例淋巴瘤病例进行CNV分析，重点关注本队列中遗传改变频率最高的10个基因：KMT2C、PIK3R1、TP53、PTEN、MTAP、SETD2、SCRN1、PTPN11、NRG1和MET。Oncoplot总结了队列中的CNV模式，每个样本注释了增益、缺失和中性区域（图3）。27例肿瘤病例中有18例在上述基因中显示至少一个CNV事件。在9例中观察到KMT2C拷贝数增益，5例中PIK3R1增益，而PTPN11在2例中表现出增益。在4例中鉴定出TP53拷贝数缺失，MTAP和PTEN各3例，MET、SCRN1、SETD2和TRAF3各2例。
讨论部分总结：据研究人员所知，这是第一篇旨在表征BMD淋巴瘤突变的研究。研究人员鉴定了几个突变，其中TRAF3、TP53、POT1、SETD2、DDX3X、MYC、MAP3K14和KDM6A先前已被报道在犬B细胞淋巴瘤中反复突变。此外，CIC基因的突变已在一篇文献中记录。这些发现支持并加强了先前发表的关于犬淋巴瘤基因组景观的数据，并显示BMD淋巴瘤与其他犬品种共享的遗传改变。本研究通过关注BMD提供了新见解，该品种已知淋巴瘤和其他癌症发病率高，但体细胞突变数据有限。通过表征该品种中的反复性体细胞突变，本研究有助于定义可能促进未来深入研究的基因组模式。在本BMD淋巴瘤队列中观察到的最常见体细胞突变是TRAF3，频率为25.9%，提示TRAF3在淋巴瘤发生中的潜在作用。TRAF3作为肿瘤抑制因子发挥作用，其失活导致核因子kappa B（NF-κB）信号通路的组成性激活和促凋亡信号的减弱，最终促进B细胞存活。在人类DLBCL中，活化B细胞样（ABC）亚型以NF-κB活性失调为特征，已知其临床行为更具侵袭性。在犬淋巴瘤中也报道了类似发现，有证据表明NF-κB/p65通路激活。在先前涉及84例犬高级别淋巴瘤的研究中，TRAF3突变被证明是犬B细胞淋巴瘤中的反复性事件，30%的肿瘤携带至少一个TRAF3体细胞突变。这些突变大多数导致TRAF3功能丧失，要么通过阅读框破坏要么由于剪接事件。Giannuzzi等人也报告TRAF3为其研究中突变最多的基因，报告了53%的突变。在Elvers等人研究三个品种淋巴瘤体细胞突变的研究中，TRAF3在30%的肿瘤中独特突变。此外，TRAF3和/或MAP3K14在50%的Cocker Spaniels B细胞淋巴瘤和30%的Golden Retrievers中突变。在本研究中，22%的患者中鉴定出TP53基因突变，另有一例拷贝数缺失（其他三个标本也携带TP53突变），使TP53改变的总频率达到25.9%。有趣的是，一部分携带TP53突变的患者 also 携带TP53拷贝数缺失，表明TP53的潜在双等位基因丢失。TP53基因是众所周知的肿瘤抑制因子，错义突变经常损害其调节细胞周期停滞、DNA修复或凋亡的能力。Coyle等人证明犬B细胞淋巴瘤中TP53突变的发生率为14%，与Elvers等人先前的发现一致，后者记录了B细胞淋巴瘤中15.6%和T细胞淋巴瘤中4.9%的突变频率。最近一项研究在25.6%的犬B细胞淋巴瘤中鉴定出突变TP53，并发现这与死亡风险增加相关，但对无进展生存期无影响。Koshino等人也报告了TP53突变在研究中具有预后意义，证明携带TP53突变淋巴瘤的犬与野生型相比具有较低的诱导治疗总缓解率（33% vs. 88%）和较短的中位生存时间（67天 vs. 264天）。同样，TP53突变淋巴瘤先前与较短的中位进展时间（53天 vs. 202天）和生存期（108天 vs. 347天）相关。进一步研究应探索双等位基因TP53丢失在犬淋巴瘤中的作用。先前发表的一项DLBCL突变谱的广泛研究表明，19只携带TP53突变的犬中有4只（21%）同时存在TP53拷贝数缺失。在当前研究中，同时鉴定出TP53突变和拷贝数缺失的病例比例更高，发生在6例携带TP53突变的病例中的3例（50%）。在人类非霍奇金B细胞淋巴瘤中，单等位基因和双等位基因TP53丢失在无进展生存期或总生存期方面无显著差异，尽管两种TP53改变均与相比TP53野生型病例显著降低的生存期相关。MYC原癌基因编码Myc转录因子，在调节细胞增殖、分化和凋亡中发挥核心作用。MYC的失调已牵涉多种人类恶性肿瘤，包括B细胞淋巴瘤。在犬B细胞淋巴瘤（cBCL）中，MYC异常也常见观察到。Giannuzzi等人研究发现19%的cBCL中MYC突变，与研究人员发现 closely 一致，其中突变频率为22%。相比之下，McDonald等人报告仅8%的犬T细胞淋巴瘤中MYC突变，提示MYC突变与B细胞表型更强的关联。此外，涉及MYC所在的13号染色体全长的染色体增益与犬DLBCL的临床分期相关。MAP3K14在本队列19%的病例中突变，且突变为互斥的。MAP3K14编码丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶14，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，结合TRAF2并刺激NF-kB活性。值得注意的是，TRAF3和MAP3K14在替代NF-κB通路的同一信号复合物中发挥作用。两个基因的突变先前已在人类经典霍奇金淋巴瘤和套细胞淋巴瘤中报道，其中MAP3K14最近已成为潜在的治疗靶点。研究人员还鉴定了PIK3R1的拷贝数增益，该基因编码PI3K的调节亚基，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响细胞生长。PIK3R1基因的功能丧失突变与淋巴增殖性疾病相关，特别是人类B细胞淋巴瘤，而拷贝数增益与活化PI3K Delta综合征（APDS）的潜在病因相关，与淋巴瘤易感性增加相关。据作者所知，PIK3R1的拷贝数增益或激活变异尚未在犬淋巴瘤患者中报道。KMT2C，甲基转移酶家族成员，参与许多组蛋白的甲基化和表观遗传调控，在BMD人群中33%的病例中发现拷贝数增益。这一发现与表观遗传失调作为淋巴瘤发生关键驱动因素的日益认识相一致。该基因在人类研究中也显示在侵袭性B细胞淋巴瘤中拷贝数增益，包括活化B细胞样（ABC）和生发中心B细胞样（GCB）亚型。虽然关于KMT2C扩增在犬淋巴瘤中作用的数据很少，但KMT2C的体细胞突变与犬T细胞淋巴瘤总生存期延长相关。最近一项人类泛癌分析表明，KMT2C突变与改善的总生存期显著相关，特别是在膀胱癌、结直肠癌、黑色素瘤和肾癌中。KMT2C突变的存在与免疫检查点抑制剂疗效增强强烈相关。值得注意的是，携带KMT2C突变的肿瘤表现出更高的肿瘤突变负荷、升高的PD-L1表达和增加的微卫星不稳定性高状态。另一个关键发现是研究人员在患者队列中鉴定了EP300基因的反复性突变。EP300，一个已知的癌基因，编码E1A相关蛋白p300，作为组蛋白乙酰转移酶发挥作用，通过染色质重塑调节转录，在细胞增殖和分化过程中重要。EP300在人类B细胞淋巴瘤的一个亚群中反复突变。最近一项研究显示10%的人类DLBCL和8.7%的滤泡性淋巴瘤携带该基因突变。值得注意的是，在研究人员队列中，EP300成为最频繁突变的基因之一，突变频率为22%。这与先前的发现形成对比，例如犬DLBCL的综合基因组分析（n=77）未鉴定出任何EP300突变。在最近一项研究中，EP300仅在全部238例犬淋巴瘤患者中的3%和B细胞淋巴瘤的5%中被鉴定。在同一研究中，另一个KAT3家族组蛋白/蛋白赖氨酸乙酰转移酶CREBBP在该队列中频繁突变，25.9%的全部患者携带该基因突变。形成鲜明对比的是，在研究人员队列中，未在任何患者中发现CREBBP突变。EP300突变在BMD中的高频率表明品种特异性特征，并为靶向该基因的药物开发提供了转化研究机会，特别是考虑到人类和犬EP300蛋白共享96.6%的序列同源性。本研究的一个局限性是缺乏关于任何先前治疗的信息和缺乏肿瘤免疫表型分类，因为研究人员无法确定队列中的病例是B细胞还是T细胞起源。尽管可以合理预期本研究中的大多数病例为B细胞淋巴瘤，这是犬包括BMD中最常见的表型，BMD具有高患病率的中心母细胞性淋巴瘤，DLBCL的一个亚型。本研究的另一个局限性是缺乏匹配的种系比较。淋巴瘤中的种系分析本质上具有挑战性，特别是当使用血液来源样本时，由于疾病的血液学性质和这些标本的混合细胞组成。一个特别关注的风险是将体细胞突变误分类为种系变异，特别是当变异发现于通常与临床表型无关的基因中时。尽管大多数动物有匹配的种系DNA（PBMCs），研究人员鉴定了许多共享突变，怀疑其反映外周血中的疾病累及。在针对PoN、种系资源（主要由Dog10k项目、dbSNP组成）过滤并将变异限制在3–95% VAF边界后，剩余变异的中位VAF为0.24，6.9%超过VAF 0.5。如此高的VAF调用可能是无配对种系样本变异检测的结果。因此，剩余的高VAF位点可能代表种系变异、高细胞密度样本中的克隆事件或拷贝数缺失或杂合性丢失区域内的变异。本文的发现应在更大的BMD淋巴瘤队列中进一步验证。未来研究应旨在验证本队列中鉴定的反复性突变，特别是EP300，可能为品种特异性改变。此外，体外实验可用于评估所发现突变对淋巴瘤发生的影响。此外，在更大的伯恩山犬淋巴瘤队列中验证这些发现可能进一步阐明这些体细胞改变的生物学意义。
结论部分翻译：本研究为BMD淋巴瘤的突变景观提供了新见解，鉴定了反复性和新型体细胞改变。除已知驱动突变（TRAF3、TP53、MYC）外，研究人员强调了EP300突变的高频率，提示潜在的品种特异性分子特征。总体而言，这些发现增进了对犬淋巴瘤生物学的理解，并可能为未来的诊断和治疗策略提供信息，特别是对于BMD等易感品种。
主要关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员采用靶向基因面板（499个癌症相关基因，约1.74 MB）对来自密歇根州立大学Berner-Garde组织资源库的27份伯恩山犬淋巴瘤新鲜冷冻组织样本进行杂交捕获富集，利用Illumina NextSeq 2000平台进行配对末端测序（100-bp reads，平均目标原始深度≥500x）。生物信息学分析采用GATK最佳实践流程，包括BWA-MEM比对至CanFam3.1参考基因组、Picard标记PCR重复、Mutect2识别SNVs和INDELs，并使用vcf2maf.pl联合Ensembl VEP进行变异注释。体细胞变异过滤使用77只健康犬buffy coat DNA组成的正常面板（PoN）及dbSNP和Dog10k项目种系数据库，VAF限定3%–95%。CNV分析采用GATK肿瘤仅CNV流程，以145只健康犬正常面板去噪。
