《Cancer Medicine》：Oncogenic hsa_circ_0000247 Promotes Breast Cancer Malignancy Through hsa-let-7i-5p Sponging-Mediated HMGA1 Upregulation
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环状RNA（circular RNAs, circRNAs）是一类稳定、进化保守且具有共价闭环结构的非编码RNA，可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡。本研究探讨了hsa_circ_0000247在乳腺癌中的功能及其调控机制。研究人员采用
环状RNA（circular RNAs, circRNAs）是一类稳定、进化保守且具有共价闭环结构的非编码RNA，可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡。本研究探讨了hsa_circ_0000247在乳腺癌中的功能及其调控机制。研究人员采用RT-qPCR和Western blotting检测hsa_circ_0000247、hsa-let-7i-5p和HMGA1的表达水平；利用CCK-8、EdU、集落形成、Transwell、流式细胞术和电子显微镜等实验评估生物学功能；通过双荧光素酶报告基因实验验证hsa_circ_0000247、hsa-let-7i-5p与HMGA1之间的相互作用，并进行挽救实验。结果显示，hsa_circ_0000247在30对乳腺癌组织及MCF-7、MDA-MB-231、BT-474细胞系中均显著上调。敲低hsa_circ_0000247可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并促进凋亡。机制上，hsa_circ_0000247直接海绵吸附hsa-let-7i-5p，后者靶向HMGA1的3′UTR。抑制hsa-let-7i-5p可逆转hsa_circ_0000247沉默所产生的效应。综上所述，hsa_circ_0000247在乳腺癌中表达上调，并通过hsa_circ_0000247/hsa-let-7i-5p/HMGA1轴促进恶性进展，为乳腺癌提供了潜在的诊断和治疗靶点。
研究背景与科学问题
乳腺癌（breast cancer, BC）是全球女性健康的重大威胁，其不同分子亚型（如Luminal A/B和三阴性乳腺癌triple-negative breast cancer, TNBC）具有高度异质性，临床结局和治疗反应差异显著。尽管过去十年间治疗手段的扩展和早期检测技术的进步使乳腺癌死亡率有所下降，但其发病率仍逐年上升。化疗效果受到复发、转移和耐药性的严重限制，尤其在TNBC等更具侵袭性的亚型中更为突出。因此，深入探究乳腺癌细胞增殖、转移和凋亡的亚型特异性分子机制，发现新的治疗靶点，对于改善患者预后至关重要。
环状RNA（circular RNAs, circRNAs）是一类具有共价闭环结构的稳定、进化保守的非编码RNA，可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤进程。已有证据表明circRNAs在乳腺癌中发挥亚型特异性作用，例如circSTIL促进TNBC进展，而circ_0007823介导Luminal亚型的顺铂耐药。微小RNA（microRNAs, miRNAs）长约22个核苷酸，主要通过结合靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）抑制翻译或促进降解来调控基因表达。hsa-let-7i-5p是let-7 miRNA家族成员，在多种癌症中作为抑癌因子发挥作用。高迁移率族蛋白A1（high-mobility group protein A1, HMGA1）是一种染色质相关蛋白，调控基因转录、DNA修复、细胞周期、分化和血管生成等关键生物学过程，其过表达与肿瘤发生、进展和化疗耐药密切相关。生物信息学分析鉴定出hsa_circ_0000247是一种源自人线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter, MCU）基因的新型circRNA。值得注意的是，此前报道的另一种MCU来源的环状转录本circHMCU可与整个let-7 miRNA家族广泛互作驱动乳腺癌进展，但hsa_circ_0000247与之存在关键区别：两者基因组剪接模式和全长序列完全不同；且本研究特异性地验证了hsa_circ_0000247仅通过海绵吸附hsa-let-7i-5p来上调HMGA1，这是此前从未被报道过的精确三分子级联通路。然而，hsa_circ_0000247在乳腺癌中的确切功能和机制尚不清楚。因此，本研究旨在系统阐明hsa_circ_0000247在乳腺癌中的表达谱、其对癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响，并验证其通过hsa_circ_0000247/hsa-let-7i-5p/HMGA1轴发挥作用的分子机制。
主要技术方法
研究人员从GEO数据库（登录号GSE101124）获取8例乳腺癌组织和3例正常乳腺组织的circRNA表达谱进行差异分析。采用RT-qPCR和Western blotting检测基因和蛋白表达水平。通过CCK-8、EdU掺入、集落形成实验评估细胞增殖能力；利用划痕愈合和Transwell实验检测细胞迁移能力；采用流式细胞术和电子显微镜观察细胞凋亡。通过双荧光素酶报告基因实验验证hsa_circ_0000247与hsa-let-7i-5p以及hsa-let-7i-5p与HMGA1 3′UTR的结合关系。通过共转染si-hsa_circ_0000247和hsa-let-7i-5p抑制剂进行挽救实验，验证该调控轴的生物学功能。临床样本来源于皖南医学院第二附属医院2024年10月至2025年10月期间手术切除的30对乳腺癌及癌旁组织。
研究结果
3.1 hsa_circ_0000247上调与乳腺癌的发生和预后相关：通过分析GEO数据库GSE101124数据集，研究人员鉴定出94个显著上调和55个下调的circRNA。hsa_circ_0000247在乳腺癌组织中显著上调，该circRNA长792 bp，由MCU基因转录本ENST00000604152.1的外显子1和2侧翼内含子反向自剪接形成。RT-qPCR证实其在MCF-7、MDA-MB-231和BT-474三种乳腺癌细胞系以及30对临床肿瘤组织中的表达均显著高于正常对照。RNase R消化实验显示hsa_circ_0000247耐受RNase R消化，而线性MCU mRNA被降解。核质分离实验揭示该circRNA主要定位于细胞质，支持其作为miRNA海绵的潜在功能。
3.2 下调hsa_circ_0000247水平抑制乳腺癌细胞增殖：在MCF-7细胞中，成功构建pcDNA3.1-hsa_circ_0000247过表达载体和si-hsa_circ_0000247敲低工具。CCK-8、EdU掺入和集落形成实验一致表明，过表达hsa_circ_0000247显著促进细胞增殖和集落形成，而敲低hsa_circ_0000247则显著抑制这些过程。
3.3 抑制hsa_circ_0000247表达阻断乳腺癌细胞迁移：划痕愈合和Transwell迁移实验结果显示，敲低hsa_circ_0000247显著抑制MCF-7细胞的水平及垂直迁移能力，而过表达则明显增强迁移能力。
3.4 抑制hsa_circ_0000247表达增加乳腺癌细胞凋亡：流式细胞术检测显示，与对照组相比，hsa_circ_0000247过表达组MCF-7细胞凋亡率显著降低，而si-hsa_circ_0000247组凋亡率显著升高。电子显微镜下观察凋亡小体的结果与流式细胞术结果一致。
3.5 hsa_circ_0000247通过hsa-let-7i调控HMGA1表达：Circbank和Circinteractome预测hsa_circ_0000247可能通过与多种miRNA互作调控下游靶基因。TCGA数据库分析显示，在预测的候选miRNA中，hsa-miR-1294在乳腺癌中过表达（与海绵调控逻辑不符），hsa-miR-1183无显著变化，而hsa-let-7i-5p表达显著下调且与hsa_circ_0000247呈相反趋势，低表达还与更差的总生存期相关。双荧光素酶报告基因实验证实hsa-let-7i-5p可直接结合hsa_circ_0000247的预测位点，且RT-qPCR显示hsa_circ_0000247过表达可下调hsa-let-7i-5p表达，敲低则上调其表达。进一步实验证实hsa-let-7i-5p可直接结合HMGA1的3′UTR，并在基因和蛋白水平负调控HMGA1表达。
3.6 hsa-let-7i抑制剂逆转si-hsa_circ_0000247对乳腺癌增殖的抑制作用：CCK-8、EdU和集落形成实验结果表明，将si-hsa_circ_0000247与hsa-let-7i-5p抑制剂共转染至MCF-7细胞，可有效抵消单独敲低hsa_circ_0000247所导致的增殖抑制效应。
3.7 hsa-let-7i-5p抑制剂逆转si-hsa_circ_0000247对乳腺癌迁移的抑制作用：划痕和Transwell实验表明，共转染si-hsa_circ_0000247和hsa-let-7i-5p抑制剂后，细胞迁移能力的恢复程度显著低于单独敲低组，即hsa-let-7i-5p抑制剂逆转了敲低hsa_circ_0000247所致的迁移抑制。
3.8 hsa-let-7i抑制剂逆转si-hsa_circ_0000247对凋亡的促进作用：流式细胞术和电子显微镜观察均显示，共转染si-hsa_circ_0000247和hsa-let-7i-5p抑制剂可显著抵消单独敲低hsa_circ_0000247所诱导的促凋亡效应。
讨论与结论
本研究发现hsa_circ_0000247在多个乳腺癌亚型和临床组织中表达上调，并能促进增殖、迁移和侵袭同时抑制凋亡，提示其作为一个泛乳腺癌治疗靶点的潜力。该研究首次鉴定了hsa_circ_0000247/hsa-let-7i-5p/HMGA1这一全新的调控轴，明确了其与先前报道的circHMCU在序列和调控特异性上的本质区别。研究人员指出，该研究的局限性包括：所有临床差异表达筛选依赖于缺乏完整ER/PR/HER2病理亚型注释的公共数据集GSE101124，无法进行亚型分层比较；体外功能验证仅在MCF-7细胞中进行，未在TNBC或HER2阳性细胞系中平行验证；所有功能证据均来自体外细胞实验，缺乏体内动物模型数据。此外，hsa_circ_0000247在化疗耐药中的作用有待进一步研究。
研究结论：研究人员发现hsa_circ_0000247在人乳腺癌细胞中表达上调，能够显著促进乳腺癌细胞的增殖和转移并抑制其凋亡。进一步的观察揭示，hsa_circ_0000247可与hsa-let-7i结合，进而促进HMGA1的表达。研究人员的发现提供了一个新的hsa_circ_0000247/let-7i/HMGA1调控轴，这为深入理解和探索乳腺癌的潜在机制提供了新的视角和理论基础。
