整合肿瘤–间质比、三级淋巴结构与肿瘤出芽的组织学衍生评分（HDS）改善结直肠癌预后分层

《Cancer Medicine》：A Histology-Derived Score Integrating Tumor–Stroma Ratio, Tertiary Lymphoid Structures, and Tumor Budding Improves Prognostic Stratification in Colorectal Cancer

　　

目的：评价整合肿瘤–间质比（TSR）、三级淋巴结构（TLS）与肿瘤出芽（TB）的组织学衍生评分（HDS）在结直肠癌（CRC）预后分层中的价值，并评估其增量预后价值。方法：回顾性纳入559例CRC患者，按7:3随机分为训练队列（n=392）与内部验证队列（n=167）。在苏木精–伊红（H&E）染色切片上评估TSR、TLS与TB以构建HDS，预设低危（3–4分）、中危（5–6分）与高危（7–8分）组。采用多因素Cox回归识别独立预后因素并纳入列线图。通过比较嵌套模型的一致性指数（C-index）、似然比检验（LRT）、净重分类改善（NRI）与综合判别改善（IDI）评估HDS的增量预后价值。结果：多因素Cox回归显示，HDS（HDShigh vs. HDSlow：HR=3.10，95% CI：1.75–5.47，p<0.001）、TNM分期（III期 vs. I期：HR=3.26，95% CI：1.49–7.12，p<0.001）及淋巴血管侵犯（LVI）（有 vs. 无：HR=1.70，95% CI：1.09–2.64，p=0.020）为无病生存（DFS）的独立预后因素。在TNM+LVI基础上加入HDS，训练队列C-index由0.709升至0.738（LRT，p<0.001；NRI=0.454，p=0.012；IDI=0.050，p<0.001），内部验证队列由0.655升至0.669（LRT，p=0.033；NRI=0.313，p=0.148；IDI=0.029，p=0.044）。列线图在两个队列中均显示良好的区分度、校准度与临床实用性。结论：HDS在TNM分期与LVI之外为CRC提供了增量预后信息。基于HDS的列线图可能有助于个体化预后评估，但仍需外部多中心验证。

一、研究背景与问题提出

结直肠癌（CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关发病与死亡的主要原因。尽管外科技术、全身化疗与靶向治疗取得显著进展，晚期CRC患者预后仍然不佳，5年总生存率约15%，提示亟需更精细的预后分层与个体化治疗策略。

目前CRC的预后评估与治疗决策主要依据肿瘤–淋巴结–转移（TNM）分期系统，该系统按原发灶解剖范围、淋巴结受累与远处转移进行分层。然而这一以解剖为核心的框架无法反映肿瘤微环境（TME）相关的生物学异质性，导致相同TNM分期的患者在实际中常出现显著不同的治疗反应与生存结局。

越来越多证据表明TME在肿瘤进展与治疗反应中起关键作用。其组织病理学组分中，肿瘤–间质比（TSR）反映肿瘤与间质成分的相对比例，低TSR与CRC不良结局一致相关；三级淋巴结构（TLS）是适应性免疫激活的有组织中枢，其存在与良好预后及增强的抗肿瘤免疫相关；肿瘤出芽（TB）是侵袭性肿瘤行为的形态学标志，与淋巴结转移、淋巴血管侵犯、早期复发及不良生存密切相关。上述三个标志物分别反映间质构成、免疫组织化与侵袭形态三个互补的组织病理学维度，且均可在常规苏木精–伊红（H&E）染色切片上评估，具备临床可行性。

然而，各标志物仅捕捉肿瘤生物学的单一侧面，单独使用可能无法充分反映CRC多维度的组织病理学异质性。鉴于TSR、TLS与TB所代表的互补信息，将三者整合为单一实用组织学框架的潜在价值尚缺乏充分探索。为此，研究人员旨在构建整合TSR、TLS与TB的组织学衍生评分（HDS）并建立基于HDS的预后模型，具体包括：整合可在常规H&E切片上评估的间质、免疫相关与侵袭性组织病理学特征；在敏感性分析中评估预设HDS界值与等权重评分方案的稳健性；定量评估HDS在TNM分期与淋巴血管侵犯（LVI）之外的增量预后价值。HDS旨在补充而非替代常规TNM分期，为CRC患者个体化预后评估与风险分层提供额外组织病理学信息。

二、研究设计与主要结论

研究人员开展了一项回顾性研究，纳入2018年1月1日至2022年9月1日在本机构病理科组织学确诊的CRC患者，纳入标准为术后确诊原发性CRC且术前未接受新辅助治疗（化疗、放疗或免疫治疗），排除有其他恶性肿瘤病史及切片质量差者。最终纳入559例合格患者，按DFS事件状态分层随机抽样，以固定随机种子（410410）按7:3分为训练队列（n=392）与内部验证队列（n=167），训练队列用于模型开发，内部验证队列用于内部验证。研究经本机构伦理审查委员会批准（批号2024–15），所有参与者均签署书面知情同意。

研究得出，HDS在TNM分期与LVI之外为CRC提供了增量预后信息；基于HDS的列线图可能有助于个体化预后评估，但仍需外部多中心验证。

三、关键技术方法

研究为单中心回顾性队列研究，样本来源于本机构病理科2018年1月至2022年9月组织学确诊的原发性CRC患者，共559例，按7:3分层随机分为训练队列与内部验证队列。主要方法包括：在常规H&E染色切片上以光镜评估TSR（按van Pelt等标准，以间质面积>50%为TSR^low、≤50%为TSR^high）、TLS（按成熟度分为早期TLS（eTLS）、初级滤泡样TLS（pTLS）与次级滤泡样TLS（sTLS））及TB（按国际肿瘤出芽共识会议（ITBCC）指南分为Bd1、Bd2、Bd3），并赋分求和构建HDS；采用最大选择秩统计量（maxstat）与两界值穷举搜索进行数据驱动的界值敏感性分析；构建Cox系数加权HDS与等权重HDS进行比较；采用多因素Cox回归筛选独立预后因素并构建列线图；通过C-index、似然比检验（LRT）、连续净重分类改善（NRI）与综合判别改善（IDI）评估增量价值；以Bootstrap重抽样、时间依赖受试者工作特征（ROC）曲线、校准曲线与决策曲线分析（DCA）评价模型性能；以Cohen's kappa与组内相关系数（ICC）评价观察者间一致性。

四、研究结果

3.1 临床病理特征：共纳入559例原发性CRC患者，训练队列392例、内部验证队列167例，中位年龄68岁（范围42–82岁），性别分布大致均衡。训练队列中HDS与肿瘤分化程度（p=0.013）、TNM分期（p<0.001）、LVI（p<0.001）、神经周围侵犯（PNI）（p<0.001）、p53表达模式（p<0.01）及错配修复（MMR）状态（p=0.049）显著相关；内部验证队列中亦观察到HDS与肿瘤分化、TNM分期、LVI及PNI的类似关联（均p<0.05）。两个队列均未观察到HDS与HER2表达或KRAS/NRAS/BRAF突变状态的显著关联。随访期间总体队列共观察189例DFS事件、169例无复发生存（RFS）事件与133例总生存（OS）事件。

3.2 观察者间一致性分析：50例随机抽取病例的分析显示，TSR分类的Cohen's kappa为0.92（95% CI：0.81–1.00），TLS成熟度分级为0.82（95% CI：0.69–0.96），TB分级为0.73（95% CI：0.57–0.89）；总HDS的ICC（2,1）为0.91（95% CI：0.84–0.95），提示一致性达显著至几乎完美水平，支持组织病理学评估与复合HDS的可重复性。

3.3 HDS风险分层的构建与评价：按预设界值，训练队列中低危、中危、高危组分别为98例（25.0%）、200例（51.0%）、94例（24.0%），内部验证队列分别为30例（18.0%）、89例（53.3%）、48例（28.7%），两队列分布模式可比（p=0.158）。数据驱动敏感性分析中，maxstat识别HDS=5为最佳单一界值；两界值穷举搜索识别5/6为最佳组合，对应低危（HDS≤5，n=211）、中危（HDS=6，n=87）、高危（HDS≥7，n=94）；第二界值与预设方案相同，第一界值仅相差1分，两种方案仅在对HDS=5患者的分类上不同。将数据驱动界值（5/6）固定并应用于内部验证队列，三组间仍保持显著分离（log-rank p=0.003）。数据驱动分组与预设分组的C-index在训练队列为0.643 vs. 0.634，在内部验证队列为0.615 vs. 0.605；连续HDS的C-index分别为0.658与0.620。等权重HDS与Cox系数加权HDS的比较显示，训练队列中加权模型C-index为0.745 vs. 0.738、AIC为1370.58 vs. 1378.46，但内部验证队列中优势甚微（C-index 0.671 vs. 0.669，AIC 540.70 vs. 541.17），故因等权重HDS更简便易解释且不实质性损害预后性能而予以保留。

3.4 预后模型的构建：训练队列单因素Cox回归识别HDS、TNM分期、LVI与PNI为DFS、RFS与OS的显著预测因素（均p<0.05）。以DFS为主要终点的多因素Cox回归中，HDS、TNM分期与LVI仍与结局独立相关，RFS与OS呈现大致相似的预后模式，但LVI对OS未保持统计学显著性。基于DFS的多因素Cox结果构建了整合HDS、TNM分期与LVI的预后列线图，分值设定为HDS^low=0、HDS^med=40、HDS^high=100分，TNM I期=0、II期=26、III期=99分，LVI无=0、有=52分，总分用于估计1、3、5年DFS事件概率。

3.5 HDS的增量预后价值：训练队列中C-index由仅含TNM模型的0.688升至TNM+LVI模型的0.709，加入HDS后进一步升至0.738，LRT显示加入HDS后模型拟合显著改善（χ²=21.982，df=2，p<0.001）；3年时连续NRI为0.454（95% CI：0.067–0.671；p=0.012），IDI为0.050（95% CI：0.019–0.106；p<0.001）。内部验证队列中C-index由TNM+LVI模型的0.655升至加入HDS后的0.669，LRT仍显著（χ²=6.829，df=2，p=0.033）；3年时IDI为0.029（95% CI：0.001–0.115；p=0.044），连续NRI为正值但未达统计学显著性（0.313；95% CI：?0.120–0.749；p=0.148）。

3.6 预后模型的内部验证：列线图在两个队列中均显示良好区分度，1、3、5年DFS预测的曲线下面积（AUC）均超过0.70。训练队列表观C-index为0.738，1000次Bootstrap后乐观校正C-index为0.729（95% CI：0.691–0.772）；1、3、5年DFS的时间依赖AUC分别为0.792（95% CI：0.725–0.851）、0.789（95% CI：0.743–0.839）与0.780（95% CI：0.716–0.839）。将训练队列模型不经重新拟合应用于内部验证队列，C-index为0.692（95% CI：0.616–0.763），相应时间依赖AUC分别为0.780（95% CI：0.650–0.890）、0.752（95% CI：0.663–0.828）与0.773（95% CI：0.672–0.870）。校准曲线显示预测与观察DFS概率吻合良好，DCA显示列线图在两个队列的多种阈值概率范围内具有潜在临床实用性。

五、讨论部分总结

研究人员在559例原发性CRC患者的回顾性分析中构建并内部验证了整合TSR、TLS与TB的HDS及基于HDS的预后列线图。该评分利用常规H&E染色切片整合反映间质构成、免疫组织化与侵袭形态的互补组织病理学特征，与TNM分期及LVI等常规临床病理因素结合后，提供了超越常规风险评估的额外预后信息，可能为CRC更精细的预后分层提供实用途径。

研究发现HDS与肿瘤分化、TNM分期、PNI、LVI及p53表达模式等临床病理特征显著相关，与Khan等、Gao等、Sullivan等及Solmaz等的报道一致。HDS与p53表达模式的关联具有潜在生物学意义，异常p53免疫组化染色模式可作为TP53改变的替代指标，而TP53改变可能通过包括cGAS/STING在内的先天免疫信号通路调节TME，但本研究未直接评估TP53改变及相关免疫信号通路，相关机制解释应视为假说性。相反，两个队列均未观察到HDS与HER2表达或KRAS/NRAS/BRAF突变状态的显著关联；训练队列中HDS与MMR状态的关联未在内部验证队列中重现，可能与dMMR病例数有限及HER2扩增、KRAS/NRAS/BRAF分子亚组病例数有限导致统计效能降低有关。

HDS的合理性在于整合反映肿瘤生物学不同维度的互补组织病理学特征：TSR反映促结缔组织增生性间质的相对丰度，其中包含癌症相关成纤维细胞（CAFs）、细胞外基质成分等可能构成物理与免疫抑制屏障、限制免疫细胞浸润并促进免疫逃逸的成分，高间质比例与免疫抑制及不良预后一致相关，但TSR单独无法捕捉有组织抗肿瘤免疫应答或侵袭性肿瘤形态等其他重要维度；TLS代表适应性免疫激活的有组织病灶，其存在与成熟度与抗肿瘤免疫应答、良好预后及免疫治疗反应性相关，但单独考虑时主要反映TME的免疫激活轴；TB与上皮–间质转化密切相关，反映肿瘤细胞的侵袭潜能，与转移及不良结局相关，并伴随抗肿瘤免疫浸润受抑等改变，但作为单一形态学参数主要反映肿瘤前沿的侵袭表型而非实际转移负荷。研究人员未发现既往研究将TSR、TLS与TB整合为单一预后框架，而Tian等报道高间质比例、高TB与低肿瘤浸润淋巴细胞共存与侵袭性表型及不良预后密切相关，与本研究HDS评分越高结局越差的发现一致。

多因素分析显示HDS、TNM分期与LVI与DFS独立相关。既往研究表明富含成纤维细胞的促结缔组织增生性间质不仅可通过物理屏障及TGF-β等免疫抑制介质抑制效应T细胞功能，还可损害功能性TLS的形成与成熟，这些观察支持间质重塑、免疫组织化与侵袭性肿瘤行为之间的生物学相互作用，但本研究未直接探究这些机制。嵌套模型比较为HDS在TNM分期与LVI之外的增量预后价值提供了定量证据，加入HDS在两个队列中均改善了模型区分度与拟合，训练队列中3年NRI与IDI均具统计学显著性，内部验证队列中IDI仍显著而NRI为正值但未达统计学显著性，提示HDS提供额外预后信息，但其增量改善的幅度与统计学强度在内部验证队列中较为有限。

关于界值选择，数据驱动的5/6方案与预设4/6方案高度一致，仅在对HDS=5患者的分类上不同；尽管数据驱动5/6方案区分度略高，研究人员仍保留预设4/6界值作为主要分析，因其系事先采用与结局无关的区间策略确定，该策略参考Kobayashi等的总体分层框架，具体界值未在本数据集针对生存结局进行优化，数据驱动5/6方案作为敏感性分析呈现以证明替代界值定义下风险分层的稳健性。

研究局限性包括：第一，作为采用内部拆分样本验证的回顾性单中心研究，HDS对独立人群及不同病理评估环境的可推广性尚不确定，随访时间不一也可能限制长期结局评估，需在随访更长的独立多中心队列中进行外部验证；第二，尽管观察者间一致性达显著至几乎完美水平，TSR、TLS与TB的组织病理学评估仍部分主观且可能因机构而异，数字病理与人工智能（AI）辅助图像分析可能有助于提高客观性、可重复性与效率并促进多中心验证；第三，瘤内异质性可能未被组织学评估完全捕捉，因TSR、TLS与TB可能在不同肿瘤区域存在空间差异，多区域采样与AI辅助全切片分析可能有助于解决该局限；第四，尽管数据驱动敏感性分析支持替代界值定义下HDS风险分层的稳健性，预设4/6界值仍需在独立外部队列中验证以确立其可推广性。

六、研究结论（译文）

总之，研究人员构建了基于H&E的整合TSR、TLS与TB的HDS，并证明其在CRC中于TNM分期与LVI之外提供额外预后信息。整合HDS、TNM分期与LVI的列线图在训练队列与内部验证队列中均显示出良好的预后性能。由于HDS基于常规H&E染色切片上可评估的组织病理学特征，它可能为CRC个体化预后评估与风险分层提供实用途径。然而，仍需在独立多中心队列中进行外部验证以确立其可推广性。