《Poultry Science》：Single nucleotide polymorphisms of the
CALB1 are associated with egg quality traits in chickens
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蛋壳品质是蛋禽生产中重要的经济性状。作为胞质可溶性钙结合蛋白，CALB1（Calbindin-D28k）能够结合Ca2?，调节钙离子转运并介导多种钙相关的生理过程。本研究以560枚济宁百日鸡鸡蛋为实验材料，在CALB1基因5′调控区共检测到25个单核苷酸多态性
蛋壳品质是蛋禽生产中重要的经济性状。作为胞质可溶性钙结合蛋白，CALB1（Calbindin-D28k）能够结合Ca2?，调节钙离子转运并介导多种钙相关的生理过程。本研究以560枚济宁百日鸡鸡蛋为实验材料，在CALB1基因5′调控区共检测到25个单核苷酸多态性（SNP）。所有25个SNP的关联分析鉴定出10个与蛋品质显著相关的位点，其中6个SNP（-919、-879、-725、-682、-541和-516）与蛋壳品质显著相关：-725位点与蛋壳厚度相关；-682位点与蛋壳比相关；-919、-879、-541和-516位点与蛋形指数相关。AliBaba 2.1预测显示，突变-879（C→T）、-682（C→G）和-516（A→G）改变了转录因子结合类型，而-725（A→G）未改变，这种结合模式的变异可能调控CALB1的表达。MethPrimer 1.0预测在1040 bp的5′调控片段内存在一个CpG岛，但六个与蛋壳品质相关的SNP均不位于该岛内。综上所述，CALB1的这六个5′调控位点具有作为济宁百日鸡蛋壳品质候选分子标记的潜力。
一、研究背景与目的
蛋壳作为鸡蛋营养物质的天然保护屏障，可有效抵御物理损伤和微生物入侵。蛋壳品质直接影响鸡蛋在储存和运输过程中的损耗率、食品安全以及消费者的感官评价。每年约有12%–20%的鸡蛋因蛋壳破损而在储存和运输过程中损失，给禽蛋产业带来巨大的经济损失。蛋壳主要由碳酸钙（约占总成分的85%）、蛋白质和少量微量元素组成，其钙化过程高度依赖于机体钙代谢稳态，钙离子（Ca2?）的转运、沉积和利用效率直接决定了蛋壳形成效率和结构完整性。因此，阐明蛋壳钙化的调控机制并改善蛋壳品质，对于降低鸡蛋破损和损失、提高家禽养殖经济效益具有重要的现实意义。
蛋壳品质受遗传、营养、饲养环境和母鸡年龄等多因素综合调控。多项研究证实，数量性状位点（QTL）可影响蛋重、蛋壳比和蛋壳颜色等蛋品质性状，在家禽中实施QTL的标记辅助选择有望加速相关经济性状的遗传改良。钙结合蛋白（CaBP）是调控Ca2?信号的核心蛋白家族，其中Calbindin-D28k是一种定位于真核细胞质的可溶性钙结合蛋白，其合成在小肠中受1,25-二羟基维生素D?调控，可直接参与钙离子转运并调节多种钙依赖性生理过程。已有研究表明，Calbindin-D28k在家禽雌性生殖过程中也发挥重要作用，其在产蛋禽子宫和输卵管中的表达水平与蛋壳钙沉积能力密切相关。然而，迄今为止尚无关于CALB1基因5′调控区和外显子区SNP位点对蛋壳品质影响的报道。基于此，研究人员以济宁百日鸡为实验群体，测定和分析蛋品质相关指标，明确该地方鸡种的蛋品质特征；采用混合池测序筛选CALB1基因5′调控区和外显子区的潜在SNP变异，随后通过直接测序确定个体基因型；对连锁的SNP位点构建单倍型和组合基因型，并进行基因型与蛋壳品质性状的关联分析，以鉴定适用于蛋壳品质选择的SNP分子标记，为济宁百日鸡的分子育种提供理论依据和遗传资源。
二、主要关键技术方法
研究人员从山东百日家禽育种有限公司同一批次43周龄的560只济宁百日鸡母鸡中收集鸡蛋，次日进行蛋品质测定，49周龄时采集血样。基于已发表的鸡Gallus gallus CALB1参考序列设计引物，通过梯度PCR确定最佳退火温度后扩增目标片段。随机选取100个样品，每10个样品各取2 μL混合成一个DNA池进行混合池测序，PCR产物经电泳确认后直接测序，使用DNAMAN和Chromas软件分析鉴定SNP。利用在线工具AliBaba 2.1预测5′调控区SNP位点突变前后转录因子结合变化，使用MethPrimer 1.0预测CpG岛分布。对560只鸡逐一进行个体基因分型，Sanger测序确定各位点基因型。采用SAS 9.2的GLM程序分析蛋品质数据并计算Pearson相关系数，使用R软件的genetics包计算遗传多态性参数并进行哈迪-温伯格平衡检验，建立统计模型分析多态位点各基因型与蛋品质性状的关联，使用Haploview软件进行连锁不平衡和单倍型分析，PHASE软件分析个体具体组合基因型并通过回归模型估计单倍型效应和互作效应。
三、研究结果
3.1 济宁百日鸡蛋品质特性统计分析
为系统评估济宁百日鸡蛋品质，研究人员测量并统计分析了关键指标。总体而言，平均蛋重为44.04 g，蛋形指数为1.31，蛋壳厚度为0.31 mm，平均蛋壳强度为38.13 N/cm2（变异系数CV=18.24%较高）。内部品质方面，平均蛋白高度为3.43 mm，哈氏单位为61.17，蛋黄比为37.60%。变异系数分析显示蛋形指数是最稳定的性状（CV=4.06%），大多数性状蕴含丰富的遗传多样性，具有较大的选育潜力，而蛋重和蛋形指数的低变异表明它们在品种培育过程中已受到选择。Pearson相关分析显示，蛋重与蛋组分间呈极显著正相关（P<0.01），蛋壳性状间呈正相关，蛋黄比与蛋白比呈极显著负相关（r=-0.96702，P<0.01），蛋白高度与哈氏单位高度同步（r=0.92098，P<0.01）。
3.2 济宁百日鸡CALB1基因SNP位点的鉴定
通过梯度PCR优化扩增体系，所有扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳验证均为单一明亮条带且符合预期大小。以鸡群混合基因组DNA为模板，用特异性引物扩增CALB1的5′调控区和所有外显子区，纯化产物测序后通过序列比对和峰图分析鉴定SNP。在5′调控区共检测到25个SNP位点（所有位置均相对于翻译起始位点ATG定位），而编码外显子中未发现SNP，表明该鸡群中CALB1编码区序列高度保守。
3.3 CALB1基因5′调控区SNP位点的群体遗传学分析
对25个SNP位点的遗传多态性进行分析，计算杂合度、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数，并进行哈迪-温伯格平衡检验。大多数位点符合哈迪-温伯格平衡，10个位点显著偏离，这可能归因于人工选择、近亲交配/非随机交配、有效群体规模小、遗传漂变、群体分层、低频等位基因或基因分型错误。此外，在该群体中10个位点仅检测到两种基因型，其余位点鉴定出三种基因型。
3.4 CALB1基因5′调控区SNP位点与蛋品质性状的关联分析
为阐明CALB1基因5′调控区序列变异对蛋品质性状的遗传效应，研究人员进行了25个SNP位点与济宁百日鸡各项蛋品质指标的关联分析。对于蛋壳品质，6个位点（-919、-879、-725、-682、-541、-516）显示出显著关联（P<0.05）。其中4个位点主要与蛋形指数相关，有利基因型可使该值提高0.76%至3.13%；-725位点与蛋壳厚度增加显著相关（AA比AG高3.33%）；-682位点与蛋壳比增加相关（CG比CC约高4.04%）。-541和-516位点的稀有纯合子样本代表性有限，需在更大群体中进一步验证。对于内部品质，3个位点（-710、-532、-516）与蛋白性状显著相关，其中-516 AA基因型使蛋白重和蛋白比分别增加8.39%和2.74%；4个位点（-683、-516、-425、-293）与蛋黄性状显著相关，其中-683 GG基因型与TT基因型相比，蛋黄比高出11.42%。
3.5 CALB1基因5′调控区SNP位点的连锁不平衡和单倍型分析
为分析CALB1基因5′调控区各SNP位点间的连锁关系，研究人员使用Haploview软件对该区域鉴定的25个SNP位点进行连锁不平衡分析。基于D′值的分析揭示了该调控区内存在多个连锁簇，-751与-735、-664与-614、以及-541与-516位点分别形成连锁域；进一步基于r2值的分析表明，-541与-516位点之间的r2值较高，提示它们之间存在强连锁关系。结合前述蛋品质性状关联分析结果，-541和-516位点均与蛋形指数显著相关（P<0.05），因此研究人员针对这两个位点构建了单倍型。
四、讨论与结论
研究结果表明，CALB1基因5′调控区的6个SNP位点（-919、-879、-725、-682、-541、-516）与济宁百日鸡的蛋壳品质性状显著相关。转录因子结合预测显示，-879（C→T）、-682（C→G）和-516（A→G）突变改变了转录因子结合类型，而-725（A→G）未引起改变，这种结合模式的变化可能调控CALB1的表达水平，进而影响蛋壳钙化过程。CpG岛预测虽在5′调控区内发现一个CpG岛，但6个蛋壳品质相关SNP均不在该岛内，提示这些位点的作用机制可能不涉及CpG岛甲基化调控。总之，CALB1的这六个5′调控位点显示出作为济宁百日鸡蛋壳品质候选分子标记的潜力，可为该地方鸡种的分子育种提供理论基础和遗传资源。
