《Poultry Science》：ENVIRONMENTAL BIOSURVEILLANCE IN COMMERCIAL POULTRY Beyond clinical signs: the case for continuous environmental biosurveillance in commercial poultry production
美国商业家禽生产正受到传染病的威胁，仅高致病性禽流感（HPAI）H5N1自2022年以来就导致超过2.06亿只家禽被扑杀，联邦疫情应对与补偿费用超过14亿美元。尽管损失规模如此巨大，商业养殖场的疾病检测总体上仍属被动反应式，依赖临床症状识别、死亡率升高和生产性能下降后才启动诊断检测。这种诊断延迟也造成了不必要的治疗紧迫性，导致部分经营者在诊断结果返回前即实施全覆盖式用药。转向主动生物监测是一种有前景的替代方案，但引入了两个新的根本性挑战：在基本无症状的鸡群中应选择哪些个体采样，以及应针对哪些病原体进行检测。环境采样方法——包括拖拭子、垫料抓取样本、靴套拭子、空气样本和水样本——为第一个挑战提供了一种解决方案，即把整个生产单元的病原排泌信号汇聚为单一混合样本。多重PCR和宏基因组学方法则为第二个挑战提供了不依赖预设靶标的方法，可在不预先指定可能致病原的情况下同时表征样本中部分或全部微生物分类群多样性。本综述旨在呈现：（1）当前鸡群健康监测实践；（2）连续环境监测的前景与局限；（3）家禽舍可用的环境样本类型范围；（4）新兴多靶标检测方法如何应对缺乏症状指导、难以确定应评估何种病原体的问题。总体而言，这些信息构成了一条有科学依据的路径，推动商业鸡群健康管理从被动疾病控制转向主动预防，但在常规商业部署可行之前，仍有大量技术和操作层面的工作有待完成。
一、研究背景与问题提出
美国商业家禽生产为消费者提供主要动物蛋白来源，并创造数百亿美元年产值。现代生产规模——数十万只的蛋鸡群、每栋数万只的肉鸡舍——使传染性病原体可在临床症状被识别之前于群体中快速传播。2022年2月在北美商业家禽中首次检出的HPAI H5N1 clade 2.3.4.4b疫情已导致美国超过2.06亿只家禽被扑杀，疫情应对与补偿成本超过14亿美元；截至2025年4月，疫情暴发以来已有逾1000个商业鸡群被清群。除HPAI外，沙门菌（Salmonella）、弯曲菌（Campylobacter）、强毒新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽偏肺病毒、马立克氏病和球虫病等亦构成持续且常相互叠加的挑战。
在此背景下，商业家禽的疾病检测数十年来基本未变，行业标准是一种观察范式：农场管理者与兽医巡查鸡舍，评估鸡只行为与外观，追踪生产指标，仅在发现异常时才启动诊断检测。该方法对明显临床病例有效，但无法识别亚临床感染或主动预防疾病。病原体在感染与临床症状出现之间的窗口期内于场内和场间循环、扩增和传播。以HPAI为例，个体鸡只的口咽分泌物和粪便排毒最早可在感染后24至48小时开始，常早于临床症状出现，而群体水平潜伏期可延长至2周甚至3周。这一临床前窗口对疾病传播和经济损失的影响十分重大。
连续生物监测——独立于临床指标、对病原体进行定期系统监测——提供了在鸡只出现临床症状之前检出风险升高或可能感染的可行性。然而，在商业养殖场实施此类监测面临直接的实际挑战：以患病动物指导采样选择的观察性监测统计抽样框架，无法在不大幅调整样本量和动物选择标准的情况下直接适用于无症状群体；样本量通常依据预期疾病流行率确定，而后者可能因具体疾病而显著变化；高密度商业环境中的个体动物采样具有侵入性，规模化操作要求高且成本昂贵。
环境采样可通过采集被整个存栏鸡群被动污染的材料——垫料、粉尘、空气和水——来应对动物选择挑战。一只靴套拭子在商业鸡舍中走过即可同时采样数千只鸡的排泄物、粉尘和皮屑，这种群体水平汇聚在许多情境下可能相对于个体动物采样提高病原检出敏感性。同一基本原理也构成用于人类传染病监测的污水流行病学（WBE）基础：COVID-19大流行期间针对SARS-CoV-2的WBE项目证明，病毒RNA可在临床病例数上升前两周即在污水中检出。但需注意，该信号是间接的，可能无法准确代表代表性人群中的活动性感染；人类污水处理厂是根本不同的生态系统，不能保证该模型完全可迁移。
环境样本采集后，第二个挑战随之出现：选择何种诊断检测。常规工具——培养、PCR、抗原免疫测定、血清学——通常设计用于检测特定的预设靶标。在主动监测中，临床症状不提供诊断指导，这些工具需要关于应寻找何种病原体的先验假设。而新兴多靶标方法如多重PCR panel、16S核糖体RNA测序和鸟枪法宏基因组测序可拓宽诊断范围，但在成本、复杂性、特异性和覆盖广度上各有取舍。
二、研究内容与结论
本综述系统考察了这一新兴生物监测范式各组成部分的证据，以及将其整合入常规商业农场管理前必须解决的挑战。作者提出，环境采样可解决动物选择难题，多靶标分子检测可解决靶标指定难题，二者结合构成从被动疾病控制转向主动预防的科学路径；但在常规商业部署可行之前，仍需大量技术与操作层面的工作。
三、主要关键技术方法
本综述为叙述性综述，未开展原始实验。所涉及的关键技术方法包括：环境样本采集方法（拖拭子、垫料抓取、靴套拭子、空气采样、饮水与洗蛋水采样）；多重PCR（multiplex PCR）panel检测；16S rRNA基因测序；鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）；实时荧光定量RT-PCR/qPCR；细菌培养；ELISA/血清学检测；抗原快速检测。综述还引用了FDA蛋品安全规则（Egg Safety Rule）与美国家禽改良计划（NPIP）等监测项目的验证数据，以及美国农业部（USDA）等相关机构的疫情统计资料。
四、主要研究结果
（一）商业家禽健康监测的现行实践与局限
商业家禽传染病检测遵循既定的观察模式：农场管理者与兽医监测鸡只行为、外观及生产参数（产蛋量、采食饮水量、死亡率），辅以死后剖检、NPIP检测及临床症状出现后的被动诊断检测。采食饮水模式被认为是鸡群应激的敏感早期指标，基于视频分析的行为、环境条件自动化监测工具亦延伸了该范式。然而所有观察性方法——无论人工观察还是自动传感——均受根本性制约：只有在感染已扰乱宿主生物学、足以改变行为、生理或生产指标后方可观察。这意味着存在临床前窗口（即潜伏期），病原体可在未被发现的情况下于鸡群中复制和传播。Mycoplasma gallisepticum（MG）潜伏期为6至21天，但在临床症状（窦部肿胀、产蛋下降）明显之前即开始排毒；禽偏肺病毒（aMPV）的临床表现与多种其他呼吸道病原高度重叠，常需实验室检测才能确诊。延迟检测的代价已有充分记录：对加利福尼亚州口蹄疫暴发的建模显示，每增加一天检测延迟都会显著增加受影响场点数量和总应对成本。此处局限并非观察技能或病原检测技术的失败，而是任何等待症状显现的检测策略所固有的。
（二）连续主动生物监测的依据
主动环境生物监测——旨在临床症状出现前检出病原体证据的系统性监测——在动物和人类健康领域并非全新。奶牛乳汁检测项目常规筛查乳腺炎相关细菌和体细胞数，独立于可见临床症状；家禽领域NPIP和FDA蛋品安全规则均依赖有限度的主动筛查以预防HPAI、Salmonella和Mycoplasma等关键病原体的重大暴发。本范式的新意在于追求对鸡舍环境中病原核酸进行连续、不依赖靶标的分子水平监测，且灵敏度足以在鸡群发生跨越临床症状阈值的暴发之前检出并鉴定潜在致病原。
一项与家禽更相关的人类WBE研究提供了佐证：对俄勒冈州20个社区551份甲型流感阳性人类污水样本的回顾性分析显示，H5亚型检出始于该州家禽HPAI首次暴发前约六周、野鸟首次检出前七周；但这些检出主要归因于野鸟输入而非农场来源，说明解读间接环境信号需审慎考虑所有可能来源。尽管如此，该发现表明环境监测可在临床识别之前检出病原存在的证据。
（三）无症状群体监测的挑战
从被动转向主动监测并非简单提高采样频率。被动诊断中，可观察的临床症状既确定采样动物，也提供部署何种诊断的背景；缺乏临床症状时，这两项优势均不存在。对于10万只鸡群、以95%置信度检测1%流行率，依据Cameron与Baldock（1998）推导的标准抽样公式需检测约300只个体动物——这是难以持续实施的后勤负担。个体动物采样方法（如泄殖腔或口咽拭子）需物理保定、对鸡只造成应激，无法对数万只动物定期持续实施。常规监测即使在临床情境下也常存在漏检：对大型商业鸡群具统计代表性亚群的采样在后勤上困难，样本运输和实验室处理的延迟在结果可用于决策之前即造成病原传播窗口。这些制约促使研究者寻求无需个体动物选择的群体水平信号采样方法。
（四）环境采样作为群体水平监测工具
环境采样作为连续生物监测工作流组成部分的核心洞见在于：商业家禽舍的物理环境被整个存栏群体持续、被动地污染。鸡只直接排粪于垫料，以肠道内容物污染垫料；通过鼻分泌物和呼气排出呼吸道病原，气溶胶化后沉降于表面、粉尘和垫料；鸡舍粉尘携带反映存栏群体总体微生物状态的大量微生物负荷。垫料尤其被视为存栏鸡群胃肠道微生物组的综合指示物：研究表明，个体鸡只肠道内容物中可检出的非致病和致病微生物——包括Campylobacter、Clostridium和Salmonella——可在群体水平从垫料样本中回收。但需注意，微生物组成在鸡舍内不同采样位置间存在差异，单一位置的单次抓取样本可能无法充分反映鸡舍环境的微生物异质性。
因此，来自上述任一基质的环境样本不是单个动物的样本，而是对该环境有贡献的整个群体的混合样本。这种群体水平整合可能相对于个体动物采样提高检出敏感性。一般而言，存在于鸡群小部分个体中的病原体很可能污染共享的垫料、空气和水。然而，影响混合样本中病原DNA/RNA检出可能性的因素众多，包括鸡群规模、活动性感染流行率、排毒量与途径、病原环境分布、采样位置、病原DNA/RNA环境持久性、样本采集体积和样本基质。简言之，汇聚可捕获个体动物样本遗漏的靶标，但同样的汇聚在高背景非致病微生物负荷下也可能稀释低流行率的病原信号。
混合环境采样已在商业家禽多种病原靶标上得到验证：比较Salmonella检测环境样本类型的研究一致发现，区域采样方法在敏感性上优于离散抓取样本；对禽流感而言，垫料、靴套拭子和空气样本等环境采样方法已在多种场景显示病原核酸检测效用；在活禽市场情境中，对多种环境样本类型的宏基因组测序在检测HPAI H5N1方面优于传统个体家禽拭子，包括检出配对个体鸡只样本未检出的流行clade。
（五）商业家禽中的环境样本类型
拖拭子由湿润织物或纱布垫在鸡舍地面拖行，采集大面积垫料、粪便及相关微生物内容物，广泛用于Salmonella监测项目，是商业家禽最成熟的环境采样工具之一。比较研究普遍发现，拖拭子和靴套拭子等主动大面积接触垫料的方法在病原核酸检测敏感性上优于离散抓取样本。拖拭子操作简单、培训要求低，主要局限在于主要采集地面水平表面微生物，不穿透垫料表层，可能遗漏不在表面累积的关键靶标。
垫料抓取样本——从一个或多个位置离散采集固定体积垫料——是操作上最直接的环境采样形式。垫料作为存栏鸡群胃肠道微生物组的综合指示物，对检测Clostridium perfringens、Eimeria spp.和Salmonella enterica亦显示效用，为常规监测提供实用且敏感的方法。但鸡舍内微生物组成在采食区、饮水区和休息区之间差异显著，单一位置抓取样本可能不足以代表群体水平病原负荷；从舍内多位置混合抓取可缓解此局限，代价是额外采集工作量。
靴套拭子——穿于鞋外走过垫料后采集的织物靴套——已被商业家禽用于Salmonella环境采样，并正被探索作为禽流感病毒口咽和泄殖腔拭子的替代或补充。鉴于垫料可作为存栏鸡群胃肠道微生物组的替代指标，火鸡群中靴套拭子亦已显示同样特性。靴套拭子法将走过鸡群环境的行为转化为一次混合采样事件。Buhr等（2007）在三项对照实验中证明，靴套样本在包括粪便、垫料抓取和拖拭子在内的所有方法中Salmonella检出率最高，在病原流行率较低的栏舍尤为突出；该优势归因于采样者足部对靴套的承重接触，相较被动拖过表面的方法可能提高含病原材料的回收。针对禽流感监测，Azeem等（2021）在人工接种H5N2低致病性禽流感（AIV）的商业蛋鸡场评估了Swiffer垫、拖拭子和靴套拭子，靴套拭子表现具有竞争力，作者认为环境采样是AIV监测中个体鸡只采样的实用替代方案。靴套拭子另具操作优势：廉价、培训要求低、对鸡群干扰小，可在常规管理巡查中采集。与拖拭子共有的局限是仅采样垫料表面，不采集表层以下材料或空气微生物组分。
商业鸡舍空气柱携带大量微生物负荷，包括呼吸道病原、经粉尘和垫料扰动气溶胶化的肠道来源微生物及环境细菌。空气采样检测禽病原体一直是活跃研究方向，尤其在HPAI背景下。Scoizec等（2018）在2016—2017年法国疫情期间从感染鸭和鸡场舍内、舍外及下风向空气样本中检出H5N8 HPAI病毒RNA，所研究的5个感染鸡群中有3个在距鸡舍50至110米处检出。Hostyn等（2025）同样证明，在含感染鸡只的鸡舍外采集的空气样本中可检出H5N1 HPAI和新城疫病毒RNA，清群、清洗和消毒后确认病毒RNA消失。一项结合空气采样与鸟枪法宏基因组测序的初步研究证明可从家禽舍空气滤膜检出Campylobacter spp.，作者将该方法描述为适用于广泛空气传播病原体。空气采样装置按采集原理分为撞击式、旋风式和滤膜式，需针对下游检测形式优化。置于通风口的自动空气采样器是连续监测特别有前景的部署策略，但硬件成本和检测特异性优化需求仍是常规商业采用的现实障碍。
水基环境采样利用鸡只持续向共享饮水排泌病原体、而饮水可为全群获取这一事实。Leung等（2007）证明活禽市场中共享家禽饮水对禽流感H9N2的分离率高于同一笼中个体粪便拭子，归因于多只鸡共享同一水槽排泌的病毒材料。Germeraad等（2020）进一步证明环境水采样在荷兰自由放养蛋鸡H10N7低致病性AIV现场暴发中的潜力，自由放养区多个地表水样本呈阳性。在蛋鸡生产中，洗蛋水——加工线上清洗鸡蛋用水——已被探索为额外候选采样基质：蛋壳在产蛋期间可从鸡舍环境中的粪便和呼吸道分泌物累积表面污染，洗蛋水因而可能捕获存栏鸡群排泌的材料。水基采样的局限包括大体积饮水系统中病原信号可能被稀释、水处理对病原回收的影响，以及不在水中以可检出水平排泌的病原代表性受限。
每种环境样本类型捕获鸡舍微生物生态的不同侧面：垫料和靴套样本主要反映跨鸡群胃肠道排泌整合的肠道病原负荷，但不穿透垫料表层；空气样本捕获呼吸道和空气传播组分，包括可能不在垫料中以可检出浓度累积的微生物；水样本可能富集分别经泄殖腔和口腔途径排入共享洗蛋和饮水系统的病原体。没有任何单一采样类型在所有病原体和监测目标上普遍最优，采样策略选择应依据最受关注病原体、生产系统类型和操作约束。资源允许时，结合垫料或靴套采样与空气或水采样的多基质方法可能提供更广的病原覆盖。比较研究证据正开始指导这些决策，但跨病原类型和生产环境的头对头前瞻性验证仍是持续调查的重要领域。
此外，适宜的环境采样方案自然取决于经营类型：蛋鸡、肉鸡和火鸡的首要关注病原体差异显著；不同病原谱和物理饲养布局也可能决定哪些采样位置及方法更适合监测各经营类型的最高风险病原体；生产周期长度和最高风险期亦因经营类型而异，早期和收获前对肉鸡和火鸡尤为相关，向产蛋高峰过渡是蛋鸡特有的重要时期；肉鸡极短的生命周期影响可基于环境生物监测采取的行动——通常结果生成时当前生长期已近结束，因此今日生成的结果更可能与同一地点未来肉鸡群相关，导致实践中形成"治鸡舍而非治鸡群"的数据使用方式。
（六）主动监测情境下的诊断局限
从被动转向主动监测，不仅改变样本采集策略，也改变对实验室检测的诊断要求。被动范式中临床症状指导检测选择：呼吸窘迫可能促使检测禽流感和新城疫，肠道症状使送检指向Salmonella、Campylobacter和球虫病，产蛋下降后检测传染性支气管炎。临床表现作为预过滤器大幅缩小相关检测范围，各情境下首选检测方法也相对成熟。而在主动环境生物监测中，除已知病因的慢性问题外，这种指导缺失，检测方法选择必须重新考虑。来自表面健康鸡群的环境样本可能携带任何病原体或其组合以及代表这些病原体的核酸。培养诊断在多数情境下仍是金标准，因其直接衡量活病原潜力，但所用培养基通常针对非常特定的病原体或相关生物群。标准HPAI PCR检测采用设计用于检测特定血凝素亚型（H5、H7）或甲型流感病毒基质基因的引物和探针，其他病原靶标亦然。设计用于检测H5和H7的panel不会检出新兴H9或H10株，也不会检出新城疫、Salmonella、Campylobacter或同一样本中可能共存的任何其他病原体。每增加一个诊断靶标通常需要单独引物或单独检测，增加成本和周转时间；即便扩展的多重panel对尚未纳入商业检测panel的新发或新兴生物仍将盲视。
快速抗原检测在临床情境中因即时检验速度而受重视，但其已知的敏感性局限降低了在低流行率检测中的效用。根据NPIP，USDA批准的禽流感快速抗原检测试剂盒获准用于患病或死亡鸡只，明确承认其性能针对临床而非亚临床应用优化。血清学监测检测既往感染抗体，提供群体水平既往暴露数据，但必然滞后活动性感染一个宿主免疫应答发展所需的时间，提供的是回顾性而非前瞻性疾病情报。
（七）拓宽病原覆盖的途径
多数诊断检测方法允许超出单一靶标的广度，但两种分子方法对解决靶标指定问题尤为有益，各有不同取舍。第一，多重PCR panel在单靶标检测与完全靶标不依赖性测序之间提供实用中间地带。多重检测可在单反应中同时检测多个预设核酸靶标，相较逐一运行各靶标检测降低成本、缩短周转时间。已发表的家禽呼吸道病原panel证明可在单管中检测多达九种共循环病原体，包括病毒和细菌。该方法的局限在于覆盖范围仍受panel设计约束：引物组未涵盖的病原体将不被检出，新发或新兴生物仍不可见。多重panel最适合可能病原体范围界定合理且相对稳定的监测情境。
第二，宏基因组测序——对样本中所有核酸深度测序，随后将序列reads计算比对参考数据库——提供根本不同的诊断框架。它不查询特定靶标，而是在不预先指定检测何种生物的情况下盘点样本中整个微生物群落。16S rRNA测序和全鸟枪法宏基因组测序均属宏基因组学范畴，但16S测序一般仅提供属水平分辨率且仅针对细菌，故讨论聚焦于靶标覆盖广得多的全鸟枪法测序。这种靶标不依赖性对病原身份可能未知群体的主动监测很有价值。二十年来单样本测序成本下降数个数量级，驱动力包括短读长平台（如Illumina）的改进和长读长平台（如Oxford Nanopore Technologies）的成熟，后者可在现场可部署规模实现更快周转。
鸟枪法宏基因组测序在环境农业样本中检测病原体的效用已在多种情境得到证明。家禽领域，Mulholland等（2021）利用宏基因组学表征商业肉鸡群从入舍到加工期的呼吸道微生物组，通过微生物群落组成变化检出与传染性喉气管炎病毒感染相关的菌群失调，与确认性PCR诊断一致。Haverkamp等（2024）证明将空气采样与鸟枪法宏基因组测序结合用于鸡舍Campylobacter检测的可行性。活禽市场情境中，对环境样本（包括空气、粪便和水）的宏基因组测序在检测HPAI H5N1方面优于传统单动物家禽拭子，包括在多次采样场合检出环境中存在但家禽拭子遗漏的流行clade。
尽管宏基因组学前景广阔，也必须注意其作为监测工具的重大局限。环境样本含有压倒性丰度的宿主来源和共生微生物核酸……（原文此处截断）
五、讨论与结论
本综述系统呈现了商业家禽环境生物监测各环节的证据基础。核心论点在于：商业养殖场中疾病检测的被动观察范式固有地存在临床前检测盲窗，而环境采样通过将整个生产单元的病原排泌信号汇聚为单一混合样本，绕过了无症状群体中个体动物选择的难题；多重PCR与宏基因组测序等不依赖预设靶标的方法，则为缺乏症状指导时确定检测何种病原体提供了解决路径。二者结合构成从被动疾病控制转向主动预防的有科学依据的路径。
同时，综述明确指出这一转变面临的实质障碍：环境信号的间接性与来源归因困难（如污水监测中H5检出主要来自野鸟输入）；混合样本在高背景微生物负荷下对低流行率信号的稀释；各样本类型在空间代表性上的固有偏差（地面采样不穿透垫料表层、不捕获空气组分）；多重panel受设计边界约束、宏基因组测序在成本、周转时间、生物信息学基础设施和标准化禽类方案方面尚不成熟，且核酸检测不能推断活病原；不同经营类型（蛋鸡、肉鸡、火鸡）在关注病原谱、饲养布局、生产周期和风险期上差异显著，肉鸡短周期更使结果常指向未来鸡群而非当前鸡群。综述结论强调，尽管该范式在科学上合理且已有多个病原靶标上的验证证据，但在常规商业部署可行之前，仍需大量技术和操作层面的工作。
