《Poultry Science》：A microscopic image analysis method for measuring in vitro sporozoite excystation rate in coccidiosis vaccines
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球虫病是一种在家禽中普遍存在且危害严重的寄生虫病，使用活卵囊疫苗进行免疫接种是其防控的核心策略之一。因此，准确测定体外子孢子脱囊率对于评估活卵囊疫苗中卵囊的活力具有重要意义。然而，目前该指标的测定主要依赖人工显微镜计数，耗时费力。本研究提出了一种用于测定球虫病
球虫病是一种在家禽中普遍存在且危害严重的寄生虫病，使用活卵囊疫苗进行免疫接种是其防控的核心策略之一。因此，准确测定体外子孢子脱囊率对于评估活卵囊疫苗中卵囊的活力具有重要意义。然而，目前该指标的测定主要依赖人工显微镜计数，耗时费力。本研究提出了一种用于测定球虫病疫苗体外子孢子脱囊率的显微图像分析方法（MIA-ER）。该流程包括显微图像采集、子孢子和孢子囊计数以及脱囊率计算。专为子孢子和孢子囊计数设计的YOLO26-SPO模型，在来自疫苗生产样本的数据集上实现了89.85%的精确率、86.55%的召回率、交并比阈值为0.50时的平均精度均值（mAP@50）为93.26%，以及mAP@50:95为83.19%。对于来自21个疫苗样本组的244张显微图像，子孢子和孢子囊计数的平均绝对误差（MAE）分别为4.123和0.844，而计算所得脱囊率的平均绝对差（MAD）为0.802个百分点。进一步与传统人工显微镜计数比较显示，两种方法所得脱囊率之间的MAD为0.611个百分点。这些结果为MIA-ER在评估条件下量化脱囊率的实际适用性提供了初步支持。所提方法也有望用于类似的子孢子计数和脱囊率评估场景，但仍需更广泛的验证。
球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的一种对全球家禽业造成重大经济损失的寄生性原虫病。活卵囊疫苗是预防和控制该病的主要策略之一。由于活卵囊的数量和活力是影响疫苗质量的重要因素，准确且高效地评估卵囊活力有助于疫苗的标准化应用。卵囊活力通常通过体内感染试验进行评估。尽管体内试验被广泛认为是可靠的，但其常规应用受限于耗时的实验流程以及动物福利和伦理问题。体外脱囊试验提供了一种在标准化条件下评估卵囊活力的实用替代方案，并减少了对动物实验的依赖。在脱囊过程中，卵囊壁被机械破坏以释放孢子囊，随后孢子囊经酶消化释放子孢子。通过显微镜计数释放的子孢子和残留孢子囊的数量，据此计算脱囊率。然而，传统的脱囊评估仍依赖人工显微镜计数，这一过程耗时费力。长时间的人工镜检可能导致视觉疲劳，从而降低计数的准确性、一致性和可靠性。这些局限性凸显了对一种客观、可重复且高效的基于图像的自动化脱囊率量化方法的需求。
近年来，计算机视觉的快速发展使得在复杂成像场景中实现越来越精确的目标检测和计数成为可能。例如，Wang等人（2020）报道DM-Count在UCF-QNRF和NWPU-Crowd测试集上分别获得了85.6和88.4的平均绝对误差（MAE）。在果园环境中，Roy等人（2019）对果实检测获得了0.95至0.97的F1分数，苹果产量估计的计数准确率为89%至98%。类似地，Froidevaux等人（2020）在甚高分辨率卫星图像中的车辆检测和计数方面实现了超过85%的精确率并保持了相对较高的召回率。这些研究共同表明了计算机视觉方法在复杂成像条件下识别、定位和量化小型或密集分布目标的潜力。尽管取得了这些进展，显微图像中的小目标检测仍然具有挑战性，因为目标对象往往仅占据几个像素，导致形态信息有限且边界模糊。此外，深度神经网络中反复的特征下采样会进一步降低细粒度空间细节，削弱小目标的判别性表示。为解决这些技术瓶颈，已有研究探索了多尺度特征融合、上下文信息增强和特征细化等策略，以增强小目标表示并提高检测性能。显微图像分析也已应用于寄生虫学研究中艾美耳球虫卵囊及其他寄生虫卵的自动检测和计数。Smith等人（2023）开发了一种在显微图像中检测和计数艾美耳球虫卵囊的自动化方法，并报道了自动化计数与人工计数之间的高决定系数（R2 = 0.99）。Liu等人（2025）对单类艾美耳球虫卵囊检测实现了98.9% ± 0.1%的mAP@50。Li等人（2025）在活卵囊疫苗样本的多类艾美耳球虫卵囊检测中实现了89.6%的mAP@50，比基线高6.5个百分点，同时参数数量和浮点运算数（FLOPs）分别减少了14%和12%。这些研究推进了艾美耳球虫及相关寄生虫的显微图像分析。然而，这些方法需要针对子孢子和孢子囊的自动计数以及脱囊率计算进行特定任务的适配。子孢子比卵囊小得多，且呈细长月牙形，检测和计数难度更大。此外，体外子孢子脱囊试验中获得的显微图像是在研磨和消化后采集的，除目标对象外还包含大量干扰颗粒，如碎片、空壳和破碎结构。
为解决这些问题，本研究开发了一种用于计算脱囊率的显微图像分析方法（MIA-ER）。主要贡献如下：（1）建立了标准化的显微图像采集方案，构建了用于模型训练和评估的体外子孢子脱囊图像数据集；（2）实现了一种血细胞计数板计数区域自动定位算法，严格遵循传统人工显微镜计数所采用的边界规则；（3）设计了定制化的YOLO26-SPO检测模型，采用增强的特征下采样策略和改进的网络架构；（4）开发了用于图像分析和脱囊率计算的专用软件。这些创新共同构成了一个完整的方法框架，其脱囊率计算性能通过人工标注和人工显微镜计数的实验评估得到了验证。
研究人员首先建立了整体工作流程，包括样本制备、图像采集、有效计数区域定位、目标检测计数和脱囊率计算。样本来自佛山市正典生物技术有限公司生产的商业化三价和四价鸡球虫病活卵囊疫苗。三价疫苗来自两个生产批次（20260402和20260703），四价疫苗来自五个生产批次（20260403、20260404、20260405、20260701和20260702）。所有样本在生产后约2个月进行检测，检测前储存于4°C。每剂疫苗含1100 ± 110个孢子化卵囊。三价疫苗含柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）和堆型艾美耳球虫（E. acervulina）的活卵囊，四价疫苗额外含有毒害艾美耳球虫（E. necatrix）活卵囊。采用标准化的六步流程进行样本处理，包括取样、沉淀离心、研磨涡旋、酶消化、二次沉淀和血细胞计数板装载。图像采集使用配备10×/0.25平场消色差物镜和2000万像素相机的生物显微镜，通过0.65×相机接口适配器连接，图像分辨率5440 × 3648像素。研究人员构建了包含154张图像的数据集，共标注85,719个子孢子和3553个孢子囊，用于模型训练、验证和测试。针对子孢子尺寸小、形态细长以及样本碎片干扰等挑战，研究人员基于YOLO26开发了定制化YOLO26-SPO模型，采用空间到深度卷积（SPD-Conv）替代部分跨步卷积以保留小目标空间细节，并设计了仅使用P4特征图的单尺度检测头和局部通道空间细化（LCSR）模块。同时开发了基于血细胞计数板网格线的自动计数区域定位算法，并编制了专用软件实现图像分析和脱囊率自动计算。实验在Ubuntu 22.04.5 LTS系统上进行，使用Intel Core i5-12600KF CPU、64 GB内存和NVIDIA GeForce RTX 3090 GPU，模型采用PyTorch 2.5.1实现，以YOLO26n为基线，使用官方预训练权重初始化。
### 检测模型对比结果
研究人员将YOLO26-SPO与YOLOv8n、YOLO11n、YOLO26n、RT-DETR、Faster R-CNN和RetinaNet等模型在相同条件下进行比较。结果显示，YOLO26-SPO取得了最高的mAP@50（93.26%）和mAP@50:95（83.19%），精确率为89.85%，召回率为86.55%。虽然YOLO26n精确率最高（90.20%），RT-DETR召回率最高（87.62%），但YOLO26-SPO在参数仅2.06 M（所有对比模型中最低）的情况下实现了最优的检测精度，推理延迟为5.54 ms/图像。与YOLO26n基线相比，YOLO26-SPO的mAP@50提高了1.41个百分点，参数减少17.6%。类别特异性分析显示，子孢子检测的AP@50达到99.03%，而孢子囊检测的AP@50为87.49%，表明孢子囊检测更具挑战性。
### 消融实验结果
消融实验评估了P4-only检测头、SPD-Conv和LCSR各自的作用。以YOLO26n为基线，P4-only检测头减少了参数和计算量并提升了mAP@50和mAP@50:95；在P4-only基础上引入SPD-Conv或LCSR均进一步改善了检测性能；完整YOLO26-SPO模型获得最高的平均mAP@50（93.25 ± 0.16%），参数比基线减少17.6%，精确率、召回率、mAP@50和mAP@50:95分别提高了1.40、1.43、1.42和0.28个百分点，表明各组件协同提升了检测能力。
### 实验对比结果
在包含244张显微图像的实验对比集中，自动计数区域定位在全部图像中成功（100%），无需手动修正。与人工标注相比，子孢子计数的MAE为4.123，RMSE为5.396；孢子囊计数MAE为0.844，RMSE为1.331；脱囊率的MAD为0.802个百分点，RMSD为1.240个百分点。Bland–Altman分析显示平均差为+0.639个百分点，95%一致性界限为?1.447至2.726个百分点。按子孢子密度分组分析，低密度（≤150）、中密度（151–250）和高密度（>250）组的子孢子计数MAE分别为3.370、3.964和5.353，表明密度越高计数误差越大。与人工显微镜计数在21个疫苗样本组中的比较显示，子孢子计数MAE为7.310，孢子囊计数MAE为0.565；脱囊率MAD为0.611个百分点，RMSD为0.756个百分点。最大的脱囊率绝对差异出现在第18疫苗组，为1.504个百分点。组水平Bland–Altman分析显示平均偏倚为+0.259个百分点，95%一致性界限为?1.169至1.686个百分点。该MAD值低于分析前设定的5个百分点实际验收标准。
### 处理时间评估
在12次重复运行中，每张图像的平均处理时间为：图像预处理0.327 ± 0.039 s，计数区域定位0.050 ± 0.001 s，目标检测0.214 ± 0.005 s，计数与后处理0.187 ± 0.037 s，总软件处理时间0.778 ± 0.069 s/图像，完整用户界面流程耗时1.825 ± 0.179 s/图像。按照研究流程各计时一次，采集12张显微图像约需87 s，而人工显微镜计数每个样本组约需9分钟。
### 讨论与结论
研究人员开发了MIA-ER方法，用于测定鸡球虫病活卵囊疫苗的体外子孢子脱囊率。该方法通过10×/0.25物镜和0.65×相机适配器采集血细胞计数板图像，在21个疫苗样本组中，图像分析与人工显微镜计数所得脱囊率的最大绝对差为1.504个百分点，平均绝对差为0.611个百分点，满足预先设定的5个百分点验收标准。网格基计数区域定位算法确保了自动计数区域与人工计数区域一致，且图像和检测结果可留存备查，提高了评估的可追溯性和可重复性。在评估条件下，端到端MIA-ER流程每样本组约需1.82分钟，而人工显微镜计数约需9分钟，显著减少了操作人员参与时间，有助于缓解视觉疲劳。本研究将显微图像分析从目标计数拓展到脱囊率评估，为活卵囊疫苗的质量评价提供了更标准化、可追溯的工具。
研究讨论部分指出，与已有的艾美耳球虫卵囊自动检测研究不同，本研究聚焦于脱囊后的子孢子和孢子囊，并利用自动计数结果计算脱囊率。该方法将显微图像分析的应用从对象计数扩展到体外子孢子脱囊率的评估，可能促进脱囊率评价的标准化和可追溯性。然而，该研究存在若干局限性：所有样本来自单一制造商，并在一个实验室在标准化条件下评估，需要跨制造商、实验室、样本条件和图像采集设置进行更广泛验证；样本仅限于三价和四价活卵囊疫苗，其他艾美耳球虫物种（如布氏艾美耳球虫E. brunetti）的疫苗需要进一步评估；本研究中疫苗样本的脱囊率普遍较高，测量范围较窄，需要在更宽的脱囊率范围内进行验证；重叠或聚集的子孢子可能难以区分，未来需包含更复杂的样本并改进模型对重叠目标的检测能力；仅评估了10×物镜采集的图像，需进一步比较不同放大倍数下的性能；还需评估焦点、照明、样本年龄和储存条件、成像硬件和实验室设置变化的影响。因此，本研究的评估涉及与人工标注和人工显微镜计数的一致性，而非对体外脱囊试验本身的独立生物学验证。
结论：本研究开发的MIA-ER方法通过自动分析显微图像测定体外子孢子脱囊率，在检测性能、计数准确性和脱囊率计算方面与人工方法表现出良好的一致性，且显著提高了效率。该方法在评估条件下可作为活卵囊疫苗子孢子脱囊率评估的有效工具，并具有扩展到类似子孢子计数和脱囊率评估场景的潜力，但需要更广泛的验证以确立其稳健性和普适性。
