RUNX1-BNIP3介导的线粒体自噬通过促进SLC25A28降解调控肝细胞铁死亡

《Redox Biology》：RUNX1-BNIP3-mediated mitophagy regulates hepatocyte ferroptosis by promoting SLC25A28 degradation

　　

本研究探讨了RUNX1-BNIP3介导的线粒体自噬（mitophagy）通过促进SLC25A28降解调控肝细胞铁死亡（ferroptosis）的机制。Lambda-cyhalothrin（LCT）暴露诱导肝损伤，伴随铁死亡和肝细胞衰老（hepatocellular senescence）。LCT破坏BNIP3依赖性线粒体自噬及线粒体质量控制（mitochondrial quality control）。RUNX1作为BNIP3的上游激活因子，保护机体抵抗LCT诱导的损伤。线粒体自噬障碍促进SLC25A28蓄积及线粒体铁过载（mitochondrial iron overload）。RUNX1过表达减轻肝细胞中线粒体自噬依赖性铁死亡。

研究背景：农药残留，尤其是拟除虫菊酯类、有机氯类和有机磷类化合物在食品和环境中的残留已成为突出的公共卫生问题，对生态安全构成持续威胁。Lambda-cyhalothrin（LCT）作为一种代表性的II型合成拟除虫菊酯，广泛用于农业和家庭害虫防治。由于其高亲脂性，一旦进入机体难以完全清除。越来越多的证据表明LCT具有内分泌干扰效应，可产生神经毒性、生殖毒性、免疫抑制、心脏毒性和肝毒性等多种毒性效应。已有研究证实LCT暴露可诱导肝脏明显的组织病理学改变和功能障碍，但其精确分子机制尚不完全清楚。细胞衰老（cellular senescence）是一种应激触发的程序，表现为细胞周期永久性停滞，伴随增殖受损和衰老相关分泌表型（SASP）的发展。越来越多的证据支持细胞衰老与肝脏疾病之间的因果关联。铁死亡（ferroptosis）是一种特殊的调节性细胞死亡类型，主要以铁过载和致死性脂质过氧化为特征，其执行受细胞铁稳态、脂质代谢和谷胱甘肽/GPX4抗氧化系统的精细调控。线粒体作为高度复杂的细胞器，在调控细胞代谢、氧化还原平衡和程序性细胞死亡中发挥核心作用。线粒体自噬（mitophagy）是一种选择性自噬，通过清除功能失调或多余的线粒体维持线粒体质量控制。BNIP3已被认定为线粒体外膜上重要的线粒体自噬调节因子。SLC25A28是位于线粒体内膜的蛋白质，作为关键的铁转运蛋白发挥作用。RUNX1参与广泛的信号通路和细胞调控过程。基于RUNX1在转录调控中的关键作用，研究人员假设LCT诱导的RUNX1下调损害BNIP3依赖性线粒体自噬并扰乱SLC25A28介导的线粒体铁稳态，从而加剧肝细胞衰老。

研究方法：研究人员采用体内小鼠模型和体外AML-12细胞模型研究RUNX1在LCT诱导肝损伤中的作用。主要关键技术方法包括：使用雄性ICR小鼠进行LCT经口灌胃暴露（1 mg/kg/day，连续28天）建立体内模型；采用AML-12细胞系进行体外研究；利用RNA-seq转录组测序分析差异表达基因；通过网络毒理学分析预测LCT潜在靶点；采用Mito-Keima腺病毒转染和mRFP-GFP-LC3腺病毒转染评估线粒体自噬活性和自噬流；通过ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证RUNX1对BNIP3启动子的转录调控；采用分子对接和分子动力学模拟分析LCT与RUNX1的相互作用；利用CETSA检测蛋白热稳定性；通过CHX追踪实验评估SLC25A28蛋白周转；采用线粒体分级分离检测线粒体组分中SLC25A28丰度。

研究结果：

3.1 LCT暴露诱导小鼠肝损伤和细胞衰老：LCT污染在全球广泛分布，在中国、美洲和印度报告的水平相对较高。组织病理学检查显示LCT处理引起肝脂肪变性、空泡变性、PAS阳性异常沉积、肝索排列紊乱、炎性细胞浸润和轻度局限性胶原沉积。血清AST和ALT水平升高表明肝功能受损。网络毒理学和转录组分析鉴定出433个重叠靶点，GO和KEGG分析富集于溶酶体功能、线粒体质量控制、谷胱甘肽代谢、铁死亡和细胞周期调控等通路。Western blot显示LCT暴露上调P21、P16、P53和γH2A.X蛋白水平，显著降低Ki67表达。IF分析证实P16和P53荧光强度显著增加。SA-β-Gal染色显示LCT暴露明显增加肝脏中蓝色SA-β-gal阳性染色。这些结果表明LCT暴露加速小鼠肝细胞衰老。

3.2 LCT暴露诱导小鼠铁死亡并抑制线粒体自噬：Western blot显示LCT暴露后铁死亡相关蛋白显著改变，包括4-HNE、SLC25A28、TF、TFRC和LPCAT3表达增加，GPX4、PCBP1、FHC、SLC3A2和SLC7A11水平降低。LCT暴露显著降低T-GSH、GSH、GSH/GSSG比值，而GSSG水平升高。T-AOC、T-SOD和CAT降低，H2O2、MDA、LPO和8-OH升高。TEM分析显示LCT暴露后线粒体超微结构损伤明显，表现为线粒体肿胀、空泡化、嵴破坏、线粒体体积密度降低和Flameng评分增加。Western blot显示LCT暴露诱导TOM20、TIM23和P62蛋白表达增加，BNIP3、RUNX1和LC3降低。IF分析显示BNIP3和LC3蛋白表达降低。相关性分析表明肝损伤与衰老、铁死亡和线粒体自噬标志物密切相关。这些结果表明LCT暴露诱导肝脏铁死亡并抑制线粒体自噬。

3.3 LCT暴露诱导肝细胞铁死亡并促进细胞衰老：CCK8实验显示随LCT浓度升高细胞活力显著降低，选择20 μM LCT进行后续实验。LCT暴露明显升高P16、P21、γH2A.X和P53表达水平，显著降低Ki67表达。IF分析显示Ki67蛋白表达降低。LCT暴露显著增加SA-β-gal阳性细胞数量和比例。EdU掺入显著减少，表明增殖活性受损。流式细胞术分析显示LCT暴露扰乱细胞周期进程，表现为G1期细胞比例增加，S和G2期细胞比例降低。LCT暴露增加4-HNE、LPCAT3、SLC25A28、TF和TFRC蛋白表达，降低FHC、SLC3A2、SLC7A11和PCBP1表达。FerroOrange和Mito-FerroGreen荧光强度显著增强，表明细胞内和线粒体亚铁含量升高。脂质过氧化和线粒体ROS水平显著升高。DCFH-DA荧光流式分析显示LCT组明显右移，表明细胞内ROS蓄积显著增加。IF分析显示LCT暴露导致细胞骨架解体。这些数据支持LCT暴露可诱导AML-12细胞铁死亡。

3.4 LCT暴露诱导线粒体损伤和肝细胞线粒体自噬抑制：LCT处理后MMP显著丧失，mPTP异常开放。Western blot显示LCT暴露导致LC3II/I、RUNX1、BNIP3、PINK1和Parkin降低，P62、TIM23和TOM20上调，而FUNDC1表达无显著改变。IF染色显示P62、TOM20和BNIP3分布相应改变。MitoTracker染色显示LCT暴露后线粒体呈更碎片化和紊乱分布。mRFP-GFP-LC3转染实验表明LCT暴露诱导黄色和红色斑点数量显著减少，表明LCT损害自噬流。Rapa恢复了LCT诱导的LC3II/I比值降低，而BafA1未能进一步影响此变化。Mito-Keima实验显示LCT暴露降低红色荧光、增加绿色荧光，表明线粒体自噬受抑制。CCCP处理逆转了LCT诱导的线粒体自噬活性降低。相关性分析揭示线粒体自噬障碍、铁死亡和肝细胞衰老之间密切关联。这些结果表明LCT暴露可诱导线粒体损伤并抑制AML-12细胞线粒体自噬。

3.5 BNIP3过表达减轻LCT诱导的肝细胞损伤：BNIP3过表达有效逆转LCT诱导的BNIP3、PINK1和Parkin蛋白水平降低及LC3II/I比值下降，同时减弱LCT诱导的P62、TOM20和TIM23蛋白水平升高。Mito-Keima分析显示BNIP3过表达显著减少绿色荧光蓄积、增强红色信号，表明线粒体自噬活性恢复。mRFP-GFP-LC3报告分析进一步证实BNIP3过表达显著减轻LCT诱导的RFP-GFP-LC3阳性斑点下调。BNIP3过表达明显减轻LCT诱导的线粒体功能障碍，表现为MMP恢复和过度mPTP开放减弱。BNIP3过表达明显改善LCT诱导的4-HNE、SLC25A28、TFRC、TF和LPCAT3蛋白水平升高，同时抵消PCBP1、GPX4、FHC、SLC3A2和SLC7A11蛋白水平降低。BNIP3过表达后细胞内和线粒体亚铁水平有效降低，抵消LCT诱导的铁过载。BNIP3过表达显著减轻LCT诱导的线粒体ROS和脂质过氧化过度产生。BNIP3过表达恢复LCT诱导的衰老相关变化，Ki67增加，P21、P16、γH2A.X和P53降低。EdU染色显示BNIP3过表达明显恢复EdU阳性细胞数量。SA-β-gal染色分析显示BNIP3过表达减弱LCT增加的β-gal阳性衰老细胞。这些结果表明LCT通过抑制BNIP3介导的线粒体自噬诱导肝细胞衰老和铁死亡。

3.6 RUNX1过表达通过调控BNIP3依赖性线粒体自噬减轻肝细胞衰老和铁死亡：RUNX1过表达恢复RUNX1、BNIP3和LC3-II/I表达，同时降低LCT诱导的TOM20、TIM23和P62水平，而这些保护作用被BNIP3敲低大部分消除。IF染色显示RUNX1过表达逆转LCT诱导的P62、TOM20和BNIP3改变，而siBNIP3削弱这些保护作用。RUNX1过表达改善碎片化和紊乱的线粒体形态，恢复MMP并减轻LCT暴露后异常mPTP开放，而BNIP3敲低减弱这些改善。Mito-Keima和mRFP-GFP-LC3实验表明RUNX1过表达明显恢复线粒体自噬活性和自噬流，而BNIP3敲低大部分逆转这些效应。RUNX1过表达明显逆转LCT诱导的GPX4、4-HNE和SLC25A28改变，而这些保护作用被BNIP3敲低大部分消除。RUNX1过表达显著减弱细胞内和线粒体亚铁蓄积，而siBNIP3逆转这些变化。RUNX1过表达明显降低线粒体ROS产生和脂质过氧化，而siBNIP3大部分消除这些保护作用。RUNX1过表达部分恢复LCT破坏的细胞骨架组织，而BNIP3敲低大部分逆转此效应。RUNX1过表达降低P21、P16、γH2A.X和P53水平并恢复Ki67表达。RUNX1过表达显著恢复EdU阳性细胞数量并减少SA-β-gal阳性衰老细胞。然而，RUNX1过表达介导的这些细胞衰老改善在BNIP3敲低后被逆转。分子对接和分子动力学模拟显示LCT与RUNX1之间存在稳定相互作用，CETSA分析进一步支持这一点。JASPAR数据库预测BNIP3启动子区域存在潜在RUNX1结合位点。双荧光素酶报告实验显示RUNX1过表达显著增强BNIP3启动子活性，而LCT暴露减弱此激活。BNIP3-WT报告基因的荧光素酶活性被RUNX1过表达显著增加，而BNIP3-MUT报告基因活性在RUNX1过表达和敲低后均未改变。ChIP-qPCR实验显示BNIP3启动子区域在RUNX1免疫沉淀物中显著富集，LCT暴露减少RUNX1在BNIP3启动子的富集，而RUNX1过表达恢复启动子占据。这些发现表明RUNX1作为BNIP3的上游转录调控因子，LCT抑制RUNX1介导的BNIP3转录。

3.7 SLC25A28作为BNIP3下游调控铁死亡和肝细胞衰老：BNIP3过表达明显恢复LCT诱导的GPX4、4-HNE和SLC25A28表达改变，而SLC25A28过表达未能减轻这些变化。BNIP3过表达有效减弱亚铁蓄积，而SLC25A28过表达逆转这些效应。BNIP3过表达减轻LCT诱导的线粒体ROS产生和脂质过氧化增加，而SLC25A28过表达明显削弱此恢复。Fer-1处理和BNIP3过表达部分恢复LCT诱导的细胞骨架分布，但SLC25A28过表达削弱这些改善。BNIP3过表达改善LCT诱导的MMP丧失，而SLC25A28过表达抵消这些效应。SLC25A28敲低减轻LCT诱导的铁死亡相关改变，而BNIP3敲低加剧这些变化。同时SLC25A28敲低逆转BNIP3缺陷诱导的铁死亡相关改变。CHX追踪实验显示LCT暴露明显延缓SLC25A28丰度下降，表明SLC25A28周转受损。BNIP3过表达加速SLC25A28降解，而BafA1或CQ抑制溶酶体功能明显减弱BNIP3诱导的SLC25A28降低。MG132对BNIP3介导的SLC25A28周转影响相对有限。线粒体分级分离显示LCT暴露增加线粒体组分中SLC25A28丰度，而BNIP3过表达明显降低线粒体SLC25A28水平，此降低被BafA1和CQ大部分阻止。共定位分析显示LCT暴露导致SLC25A28明显蓄积，伴随与LC3阳性组分和LAMP1阳性组分共定位减少。BNIP3过表达降低SLC25A28丰度并增强其与LC3阳性自噬结构和LAMP1阳性溶酶体组的关联。铁死亡靶向药理干预实验显示LCT暴露明显增加4-HNE蓄积，而Fer-1、Lip-1或DFO处理后这些改变显著逆转。Fer-1和Lip-1有效抑制脂质过氧化反应，DFO也通过限制铁依赖性脂质过氧化减弱C11-BODIPY氧化。LCT暴露仅引起凋亡相关标志物Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的适度变化，未明显激活RIPK3/MLKL信号通路。BNIP3过表达降低P21、γH2A.X、P16和P53表达同时恢复Ki67水平，而SLC25A28过表达大部分逆转这些变化。Fer-1处理和BNIP3过表达恢复LCT诱导的Ki67阳性信号降低，此恢复也被SLC25A28过表达消除。EdU染色进一步表明BNIP3过表达恢复LCT损害的增殖能力，而SLC25A28过表达明显减弱此恢复。SA-β-gal染色显示BNIP3过表达赋予的AML-12细胞衰老抑制也被SLC25A28过表达逆转。Fer-1和Lip-1明显减弱LCT诱导的P16、P21、P53和γH2A.X增加，同时恢复Ki67表达、EdU掺入并减少SA-β-gal阳性细胞比例。DFO产生类似保护作用，NAC也部分减轻这些衰老相关改变。这些发现表明LCT损害SLC25A28周转，导致亚铁蓄积和脂质过氧化增强，进而促进铁死亡和肝细胞衰老。

讨论部分总结：本研究鉴定RUNX1为保护肝细胞抵抗LCT诱导衰老的调节因子。RUNX1作用于BNIP3上游，维持BNIP3依赖性线粒体自噬并促进SLC25A28清除。LCT暴露抑制RUNX1，破坏此保护效应，导致BNIP3转录减少和BNIP3依赖性线粒体自噬缺陷，进而促进SLC25A28蓄积、铁依赖性氧化损伤，最终导致肝细胞衰老。本研究主要发现是鉴定RUNX1为BNIP3的上游转录激活因子。RUNX1或BNIP3过表达有效逆转线粒体自噬缺陷、减少SLC25A28蓄积、抑制铁死亡并减轻衰老，而BNIP3敲低消除RUNX1的保护作用。SLC25A28作为该通路的关键下游效应因子，其过表达逆转BNIP3赋予的保护作用。研究人员还讨论了LCT诱导的肝组织病理学改变伴随严重线粒体超微结构异常，LCT加速肝细胞衰老，铁死亡是LCT诱导肝损伤的重要机制，LCT阻断自噬流并抑制线粒体自噬，BNIP3下调是LCT诱导肝毒性中线粒体自噬缺陷的重要分子事件，RUNX1直接调控BNIP3转录从而维持BNIP3依赖性线粒体自噬，SLC25A28介导的线粒体铁失调参与LCT诱导的铁死亡。研究局限性包括PINK1/Parkin和FUNDC1在LCT诱导线粒体自噬障碍中的功能 involvement 未系统评估，BNIP3L/NIX未进一步研究，未来需要通路特异性干预和时间过程分析，以及慢性低剂量暴露和毒代动力学分析。

研究结论翻译：总之，本研究阐明RUNX1是抵抗LCT诱导肝损伤的重要保护因子。LCT暴露抑制RUNX1-BNIP3依赖性线粒体自噬，从而损害含SLC25A28线粒体物质的溶酶体依赖性周转，促进线粒体铁失调、铁死亡相关损伤和肝细胞衰老。这些发现强调RUNX1-BNIP3-SLC25A28轴是LCT诱导肝毒性的重要调控组分，提示调控该通路可能作为减轻LCT诱导肝损伤的有前景的方法。