酰氧酰基水解酶通过降解氧化磷脂预防博来霉素诱导的肺损伤与肺纤维化

《Redox Biology》：Acyloxyacyl hydrolase prevents bleomycin-induced lung injury and fibrosis by degrading oxidized phospholipids

　　

酰氧酰基水解酶（AOAH）是一种真核脂酶，最初因其对革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）进行脱酰基失活的能力而被发现。除作用于LPS外，AOAH还对磷脂和溶血磷脂表现出脱酰基活性。研究人员近期报道AOAH可降解氧化磷脂（PGPC和POVPC），从而降低其激活炎症小体并刺激巨噬细胞释放IL-1β的能力。然而，AOAH能否通过降解氧化磷脂来预防肺纤维化仍不清楚。为探究AOAH在肺纤维化中的保护作用，研究人员采用了博来霉素（BLM）诱导的小鼠模型，该模型再现了人类特发性肺纤维化（IPF）的病理生理和分子特征。BLM通过激活分子氧和氧化性DNA损伤引发氧化性肺损伤。线粒体功能障碍和吞噬细胞NADPH氧化酶衍生的活性氧进一步放大这种损伤。气管内给予基于体重剂量的BLM后，小鼠在最初7天内出现急性肺部炎症和损伤，随后在第7至14天之间发生纤维化重塑。研究结果表明，AOAH可预防BLM诱导的肺损伤和纤维化。值得注意的是，BLM暴露后，Aoah^-/-小鼠肺部氧化磷脂（oxPLs）水平升高，气道巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化增强。给予外源性AOAH在很大程度上挽救了Aoah^-/-小鼠。通过降解oxPLs，AOAH减轻了肺部炎症和纤维化的严重程度。AOAH可能成为治疗IPF患者的有前景的候选药物。

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性、危及生命的疾病，治疗选择有限。尽管IPF的确切发病机制尚未完全阐明，但已知遗传易感性、环境因素和特发性触发因素之间复杂的相互作用驱动疾病进展。衰老、感染、过敏或化学/辐射暴露等情况可能导致肺泡上皮屏障损伤，启动异常的伤口愈合反应，其中失调的组织修复最终导致纤维化形成。由此产生的瘢痕形成破坏肺结构，损害气体交换，最终导致致命的呼吸衰竭。肺部衰老、炎症和损伤诱导氧化应激。肺细胞膜和表面活性物质脂蛋白含有丰富的磷脂，易被氧化。氧化磷脂（oxPLs）既是铁死亡的产物也是执行者，铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式。此外，作为典型的损伤相关分子模式（DAMP）分子，oxPLs引发炎症和肺泡屏障损伤。特定的oxPL种类，如1-棕榈酰-2-戊二酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PGPC）和1-棕榈酰-2-(5-氧代戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POVPC），可诱导巨噬细胞中NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化，并触发促炎细胞因子IL-1β的加工和释放。研究人员及其他研究者发现oxPLs加重急性肺损伤（ALI）和纤维化。Tang等报道表达E06（一种天然oxPL中和抗体）的转基因小鼠免于BLM诱导的肺纤维化，强调了oxPLs在疾病发病机制中的关键作用。在BLM诱导的肺损伤小鼠模型中，Gasse等证明NLRP3炎症小体活化对肺部炎症至关重要，且需要尿酸参与。与小鼠模型中的发现一致，患者研究表明NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生参与IPF及其急性加重的发病机制。oxPLs在多大程度上促进NLRP3炎症小体活化和肺部病理仍不确定。酰氧酰基水解酶（AOAH）是一种真核脂酶，最初因其对革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）进行脱酰基失活的能力而被发现。除作用于LPS外，AOAH还对磷脂和溶血磷脂表现出脱酰基活性。研究人员近期报道AOAH可降解氧化磷脂（PGPC和POVPC），从而降低其激活炎症小体并刺激巨噬细胞释放IL-1β的能力。AOAH能否通过降解氧化磷脂来预防肺纤维化仍不清楚。为探究AOAH在肺纤维化中的保护作用，研究人员采用了BLM诱导的小鼠模型，该模型再现了人类IPF的病理生理和分子特征。BLM通过激活分子氧和氧化性DNA损伤引发氧化性肺损伤。线粒体功能障碍和吞噬细胞NADPH氧化酶衍生的活性氧进一步放大这种损伤。气管内给予基于体重剂量的BLM后，小鼠在最初7天内出现急性肺部炎症和损伤，随后在第7至14天之间发生纤维化重塑。研究结果表明，AOAH可预防BLM诱导的肺损伤和纤维化。值得注意的是，BLM暴露后，Aoah^-/-小鼠肺部oxPLs水平升高，气道巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化增强。给予外源性AOAH在很大程度上挽救了Aoah^-/-小鼠。通过降解oxPLs，AOAH减轻了肺部炎症和纤维化的严重程度。AOAH可能成为治疗IPF患者的有前景的候选药物。研究人员首先分析了来自健康对照和IPF患者外周血单核细胞（PBMCs）的单细胞RNA测序数据。正如预期，AOAH在单核细胞、树突状细胞、NK细胞和CD8⁺T细胞中表达。进展性和稳定性IPF患者的外周经典单核细胞（CD14⁺CD16^-）中AOAH表达均显著降低。此外，当比较个体内各单核细胞亚群中AOAH表达的几何均值时，研究人员发现进展性IPF组的经典单核细胞中表达显著降低。这些结果表明低AOAH丰度与IPF相关。随后研究人员探究了AOAH是否预防BLM诱导的急性肺损伤。为确保可比的微生物群，Aoah^+/+和Aoah^-/-小鼠共同饲养至少3周。随后，共同饲养的小鼠气管内注射PBS或BLM。BLM攻击后，Aoah^-/-小鼠体重下降显著多于Aoah^+/+小鼠。注射后第7天，BLM处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白浓度升高，且Aoah^-/-小鼠BALF蛋白浓度更高，提示更严重的肺泡屏障损伤。组织学分析显示BLM诱导肺泡壁增厚和免疫细胞浸润；Aoah^-/-小鼠肺部病理更严重。Masson三色染色进一步证明Aoah^-/-小鼠肺胶原沉积增加和Ashcroft纤维化评分更高。BLM注射的Aoah^-/-小鼠BALF和肺匀浆中炎症细胞因子IL-6和趋化因子KC和MCP1浓度升高。值得注意的是，促纤维化细胞因子TGF-β1水平也升高。一致地，BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中促纤维化基因Col1a1、Fn1、Timp1表达增加，抗纤维化基因Mmp2表达降低。此外，与Aoah^+/+对照相比，BLM注射的Aoah^-/-小鼠BALF和肺组织中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞积累显著增加。总之，Aoah^-/-小鼠在BLM气管内注射后7天肺部炎症和组织损伤更严重。接下来研究人员探究了AOAH是否对BLM诱导的肺纤维化提供保护。共同饲养的Aoah^+/+和Aoah^-/-小鼠气管内注射PBS或BLM。BLM攻击后，Aoah^-/-小鼠在接下来14天内体重下降多于对照小鼠。第14天时，两种基因型之间BALF蛋白浓度相当。组织学检查显示Aoah^-/-小鼠肺部炎症和胶原沉积较Aoah^+/+小鼠加重。Aoah^-/-小鼠肺疾病活动度和Ashcroft纤维化评分均显著升高。尽管大多数BALF细胞因子和趋化因子水平较第7天下降，但Aoah^-/-小鼠肺中IL-6、KC和TGF-β1水平仍显著高于对照。此外，Aoah^-/-小鼠BALF中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、单核细胞衍生巨噬细胞和CD8⁺T细胞数量显著增加，提示炎症持续。BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、Acta2、Fn1和Timp1表达升高。成纤维细胞分化为肌成纤维细胞是肺纤维化的关键特征。BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中肌成纤维细胞标志物α-SMA水平升高。BLM处理后，羟脯氨酸水平升高，在Aoah^-/-小鼠肺中达到更高水平，证实胶原沉积增加。BLM处理的Aoah^-/-小鼠表现出肺阻力增加，动态肺顺应性和分钟通气量降低，提示肺功能受损。因此，BLM处理后14天，Aoah^-/-小鼠肺部炎症、纤维化和功能损伤更严重。为阐明AOAH介导的BLM诱导肺损伤保护的机制，研究人员对BLM气管内注射后7天的肺组织进行了RNA测序（RNA-seq）。Aoah^+/+和Aoah^-/-小鼠肺差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）显示铁死亡通路显著富集。具体而言，BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中促铁死亡基因表达上调，包括血红素加氧酶1（Hmox1）、铁蛋白轻链（Ftl1）、核受体共激活因子4（Ncoa4）和STEAP3金属还原酶（Steap3），同时抗铁死亡基因如谷胱甘肽合成酶（Gss）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（Gclc）表达下调。研究人员使用qPCR确认了重要的RNA-seq结果。BLM处理导致表面活性蛋白C（SP-C）丰度降低；值得注意的是，Aoah^-/-小鼠肺中SP-C水平更低，提示产生SP-C的肺泡II型细胞耗竭。GPX4（一种减轻脂质过氧化以预防铁死亡的关键酶）水平在BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中降低。研究人员还观察到BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺上皮细胞中过氧化脂质和Fe²⁺水平升高，表明脂质过氧化加剧和铁死亡活性增强。总之，这些数据表明BLM在缺乏AOAH时诱导更严重的脂质过氧化并可能加剧铁死亡。BLM暴露的Aoah^+/+和Aoah^-/-小鼠肺差异表达基因的GSEA显示IL-1β产生正调控通路显著富集。BLM气管内注射后，与Aoah^+/+小鼠肺相比，Aoah^-/-小鼠肺中炎症小体相关基因表达水平持续升高。使用Western blotting，研究人员发现BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺中NLRP3、caspase 1、cleaved caspase 1和cleaved IL-1β水平升高，提示caspase 1和IL-1β加工增加，因此炎症小体过度活化。这种差异在纯化的BALF巨噬细胞（包括肺泡巨噬细胞和单核细胞衍生巨噬细胞）中更为明显，这些是主要表达Aoah基因的细胞。鉴于BLM处理的肺上皮细胞表现出脂质过氧化和铁死亡迹象，研究人员假设巨噬细胞炎症小体过度活化由上皮来源的oxPLs触发。为验证这一假设，研究人员用BLM处理肺上皮细胞系MLE-12，并使用条件培养基刺激TLR2激动剂Pam3CSK4（Pam3）预处理的Aoah^+/+或Aoah^-/-巨噬细胞。BLM处理的MLE-12条件培养基诱导Aoah^-/-巨噬细胞释放IL-1β多于对照细胞；oxPL结合抗体E06处理削弱了这种效应。这些结果表明BLM暴露后肺上皮细胞产生的oxPLs诱导巨噬细胞炎症小体活化，且AOAH在此过程中发挥调节作用。为确定AOAH是否调节BLM暴露后肺中oxPL丰度，研究人员使用E06抗体定量BALF中的oxPLs。BLM处理增加小鼠BALF中oxPLs，且Aoah^-/-小鼠肺部oxPLs多于Aoah^+/+小鼠，提示通过降解oxPLs，AOAH防止过度炎症小体活化从而减少肺损伤和纤维化。为进一步探究oxPLs在BLM诱导急性肺损伤发展中的作用，研究人员在BLM处理前21天通过气管内注射给予小鼠肺嗜性腺相关病毒（AAV6）-E06。AAV6-E06处理显著上调E06表达，并明显减轻Aoah^-/-小鼠BLM诱导的体重下降和肺病理。此外，AAV6-E06抑制BLM暴露的Aoah^-/-小鼠肺中促铁死亡基因表达，同时增强抗铁死亡基因Gpx4表达。一致地，AAV6-E06处理降低BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺上皮细胞中脂质过氧化和Fe²⁺水平。AAV6-E06还减少Aoah^-/-小鼠BALF中免疫细胞浸润。重要的是，AAV6-E06显著降低肺中NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β蛋白水平。总之，这些发现表明oxPL诱导的炎症小体活化关键促进Aoah^-/-小鼠肺部炎症和损伤的加重。既往研究已证明oxPLs诱导巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化和IL-1β释放。为确认PGPC或POVPC以NLRP3依赖方式诱导巨噬细胞释放IL-1β，研究人员从Aoah^+/+、Aoah^-/-和Aoah^-/-Nlrp3^-/-小鼠分离腹腔巨噬细胞，用Pam3预处理，随后用PGPC或POVPC刺激。与先前结果一致，Aoah^-/-巨噬细胞释放的IL-1β多于Aoah^+/+巨噬细胞。值得注意的是，NLRP3缺陷完全消除了IL-1β释放，确认PGPC和POVPC激活NLRP3炎症小体促进IL-1β分泌。随后研究人员用BLM气管内注射Aoah^-/-Nlrp3^-/-小鼠，观察到NLRP3缺陷部分预防Aoah^-/-小鼠的体重下降、肺病理和炎症小体活化。鉴于Zanoni等报道oxPAPC结合caspase-11诱导树突状细胞中IL-1β释放，研究人员还用BLM注射Aoah^-/-Caspase11^-/-小鼠。然而，caspase-11缺陷未减少体重下降或抑制BLM诱导的肺损伤和纤维化，表明oxPL诱导的caspase-11活化在BLM诱导的肺病理中非必需。总之，这些结果表明BLM处理后，Aoah^-/-小鼠肺中oxPLs诱导NLRP3炎症小体过度活化，导致更多炎症、肺损伤和oxPL产生。因此，通过降解oxPLs，AOAH减少NLRP3炎症小体活化，从而预防肺损伤和随后的纤维化。为确定外源性AOAH是否能挽救BLM处理的Aoah^-/-小鼠表型，研究人员在BLM攻击前21天气管内注射AAV6-AOAH。该处理方案增加肺中AOAH表达，并成功预防BLM处理的Aoah^-/-小鼠典型的体重下降。组织学分析显示AAV6-AOAH给药减少肺病理并减轻纤维化严重程度。此外，AAV6-AOAH给药抑制BLM暴露的Aoah^-/-小鼠肺中促铁死亡基因表达，同时增强抗铁死亡基因Gpx4表达。一致地，AAV6-AOAH降低BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺上皮细胞中铁死亡标志物。此外，AAV6-E06减少Aoah^-/-小鼠BALF中免疫细胞浸润。值得注意的是，BLM暴露后，外源性AOAH显著降低Aoah^-/-小鼠肺中pro-caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β水平。总之，这些发现证明外源性AOAH减轻BLM诱导的肺铁死亡活性、炎症、损伤和纤维化。讨论部分指出，AOAH是一种降解oxPLs的真核脂酶，从而限制巨噬细胞中oxPL诱导的炎症小体活化。本研究发现IPF患者经典单核细胞中AOAH表达降低，提示AOAH不足与IPF之间的潜在关联。使用BLM诱导的急性肺损伤及后续纤维化模型，研究人员证明AOAH减轻肺部炎症、组织损伤和纤维化。AOAH还减少肺上皮细胞中脂质过氧化和铁死亡相关变化，并通过减少oxPL丰度限制肺部NLRP3炎症小体活化。此外，使用肺嗜性AAV6载体递送AOAH改善BLM诱导的肺病理和炎症小体活化。这些发现支持一个工作模型：BLM诱导的氧化应激促进细胞膜和肺表面活性物质中磷脂的氧化。巨噬细胞摄取这些oxPLs激活NLRP3炎症小体，导致IL-1β的成熟和释放。IL-1β随后放大肺部炎症和上皮氧化应激，可能促进上皮铁死亡和进一步oxPL释放到肺泡空间。这种自我放大的循环维持肺损伤和纤维化。通过降解oxPLs和限制NLRP3炎症小体活化，AOAH可能中断这一致病循环。既往研究已确定oxPLs是肺纤维化的重要介质。Romero等证明BLM暴露诱导肺泡上皮细胞脂质释放到气腔，随后oxPL在肺泡巨噬细胞中积累和泡沫细胞形成。单独气管内给予氧化磷脂酰胆碱（oxPC）足以诱导肺纤维化。与这些发现一致，oxPL中和抗体E06的表达显著改善小鼠BLM诱导的肺纤维化。IPF患者中也报道了肺oxPL丰度增加。Yoshimi等在IPF肺的肺泡空间中检测到oxPC，主要位于肺泡巨噬细胞内，而健康对照肺中未检测到。由于oxPLs既是铁死亡的产物也是介质，这些观察也暗示铁死亡性细胞死亡参与肺纤维化。在本研究中，BLM处理的Aoah^-/-小鼠肺上皮细胞表现出更大的脂质过氧化和升高的Fe²⁺水平，伴随肺oxPL水平增加。相反，外源性AOAH减少上皮铁死亡相关变化，支持AOAH在限制oxPL积累和上皮损伤中的保护作用。总之，研究人员的发现表明上皮铁死亡和oxPL诱导的炎症可能形成相互强化的循环，加剧肺损伤和纤维化。鉴于肺上皮细胞不表达AOAH，一种可能的机制是AOAH通过抑制巨噬细胞中oxPL诱导的炎症小体活化，从而减少炎症和氧化应激，间接保护这些细胞。支持这一解释的是，BLM处理的肺上皮细胞释放的oxPLs在体外刺激巨噬细胞IL-1β释放，而AOAH显著减弱这种反应。类似地，先前工作表明辐照的凋亡A549细胞（人肺泡上皮细胞系）通过ROS依赖机制诱导支气管肺泡灌洗细胞中NLRP3炎症小体活化。越来越多的证据表明NLRP3炎症小体活化参与IPF发病机制。在BLM诱导的肺损伤模型中，Gasse等证明NLRP3炎症小体活化在疾病进展中是必需的，并提出尿酸作为上游DAMP。然而，其他内源性介质的贡献仍不完全清楚。研究人员使用NLRP3缺陷小鼠以及oxPL中和的实验支持oxPL驱动的NLRP3炎症小体活化的致病作用。BLM暴露促进ROS产生和脂质过氧化，肺上皮细胞和表面活性物质可能是oxPLs的来源。这些oxPLs随后可激活巨噬细胞中NLRP3炎症小体。与这一机制一致，AAV6-E06介导的oxPL中和显著抑制炎症小体活化。总之，这些发现确定oxPLs作为连接氧化性肺损伤与NLRP3依赖性炎症和纤维化的内源性介质，在此模型中具有潜在的IPF相关性。NLRP3缺陷仅部分减轻疾病严重程度，表明其他通路也参与肺损伤和纤维化。除炎症小体活化外，oxPLs可通过其他几种机制促进炎症、细胞死亡和组织损伤。例如，某些oxPLs激活Toll样受体（包括TLR4和TLR2）启动促炎信号。POVPC刺激线粒体ROS产生和线粒体去稳定化，而POVPC和PGPC均可通过神经酰胺生成促进巨噬细胞凋亡。氧化PAPC（oxPAPC）也有报道在树突状细胞中结合caspase-11并诱导IL-1β释放而不引起细胞死亡。然而，在研究人员模型中，caspase-11缺陷未保护Aoah^-/-小鼠免受BLM诱导的肺损伤，提示caspase-11在这些条件下不是病理的主要驱动因素。除AOAH外，几种酶可使oxPLs脱酰基。溶酶体磷脂酶A2降解oxPLs，并已被证明减轻BLM诱导的肺纤维化。血小板活化因子乙酰水解酶2（PAF-AH2）从oxPLs的sn-2位去除截短的脂肪酰链，减少其对内皮细胞的有害作用。卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）也水解oxPC生成溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）。AOAH的一个显著特征是其能够从oxPLs的sn-1和sn-2位去除脂肪酰链。这种双重脱酰基活性使oxPLs更完全降解，同时限制lysoPC的积累，而lysoPC本身可促进炎症或组织损伤。研究人员的发现表明，尽管存在其他oxPL降解酶，AOAH在BLM诱导的肺损伤和纤维化中具有非冗余的保护作用。AOAH主要表达于吞噬性免疫细胞，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞，但不表达于肺上皮细胞。这种表达模式提示AOAH可能主要在肺吞噬细胞中调节oxPL诱导的炎症小体活化。AOAH还可能保护巨噬细胞活力，因为它保护这些细胞免受oxPL诱导的死亡。然而，其保护作用可能超出产生AOAH的细胞。AOAH可被分泌并随后被不表达它的细胞内化。肺上皮细胞是否摄取免疫细胞来源的AOAH，以及这种摄取是否直接限制BLM诱导的铁死亡，仍有待确定。给予AOAH或E06并未完全保护Aoah^-/-小鼠免受BLM诱导的肺损伤。这种不完全保护可能反映BLM的其他细胞毒性效应，包括DNA链断裂，或其他内源性介质的贡献，如尿酸。BLM模型与人类IPF之间的差异也需要考虑。BLM诱导急性损伤后纤维化，而IPF通常进展数年。持续的上皮损伤和低度炎症可能维持肺oxPL积累，从而促进疾病进展。尽管研究人员的发现支持靶向oxPLs的治疗，但需要进一步研究以确定AOAH补充或E06介导的中和是否能限制已建立的纤维化并在慢性疾病环境中提供益处。AOAH最初被鉴定为对革兰氏阴性菌LPS脱酰基从而限制LPS诱导炎症的脂酶。研究人员的发现将这种保护功能扩展到无菌性肺损伤，表明AOAH介导的oxPL降解减轻氧化应激、炎症、组织损伤和纤维化。通过灭活微生物PAMP（LPS）和内源性DAMP（oxPLs），AOAH连接了微生物性和无菌性炎症反应的消退。这些结果为进一步研究AOAH作为肺纤维化和其他与持续oxPL积累相关疾病的治疗靶点提供了依据。研究结论部分翻译如下：IPF患者外周经典单核细胞中AOAH表达降低。AOAH减轻小鼠BLM诱导的肺损伤和纤维化。AOAH减少致病性氧化磷脂在肺部的积累。氧化磷脂激活NLRP3炎症小体，加剧肺部炎症和损伤。外源性AOAH给药作为IPF的潜在治疗策略值得进一步研究。