疏水性共价有机框架作为Diutina (Candida) rugosa脂肪酶瞬时高效固定化平台：提升酶活性的简单策略

《ChemPlusChem》：Hydrophobic Covalent Organic Frameworks as a Platform for Instantaneous and High-Capacity Immobilization of Diutina (Candida) rugosa Lipase: A Simple Strategy to Boost Enzyme Activity

　　

共价有机框架（Covalent Organic Frameworks, COFs）正逐渐成为酶固定化领域颇具前景的平台；然而，其结构和化学性质对吸附行为及酶活性的影响尚未得到充分探索。本研究将Diutina rugosa脂肪酶（DrL）固定化于四种由简单、商业化可得前体合成的COFs（RIO-12、RIO-13、RIO-54和RIO-55）上。研究人员评估了COF化学组成和织构性质对吸附动力学及催化性能的影响。固定化几乎瞬时完成，无论使用何种COF，均在10 s内达到完全固定，负载效率为99.8%–99.9%，蛋白质结合容量约为44 mg g^?1载体，所有复合物在每个洗涤循环中的酶泄漏低于0.3%。研究结果表明，富含芳香族和含氮官能团的全有机COF表面对脂肪酶表现出强亲和力，使得主要以疏水相互作用驱动的快速固定化得以实现，而孔径和比表面积起次要作用。相比之下，酶活性受比表面积的强烈影响，可能通过正向分配效应（positive partition effect）增加酶附近的局部底物浓度。值得注意的是，RIO-12表现出显著增强的活性，其比活性比游离酶高14.8倍（408.5 vs. 27.7 U mg^?1）。

**研究背景与问题**

脂肪酶（triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3）因其卓越的催化多样性而成为食品、制药、化工和生物燃料等行业的重要生物催化剂。然而，游离脂肪酶在工业应用中常受限于操作稳定性差、回收困难及重复使用性有限等问题。将酶固定化于固体载体上是克服这些缺陷的有效策略，可提高酶稳定性、便于催化剂回收并在许多情况下增强催化性能。该策略的成功不仅取决于固定化方案，还取决于载体的结构和化学特征，包括表面化学、疏水性、孔结构和可及比表面积。

在众多用于酶固定化的多孔材料中，共价有机框架（COFs）因其高比表面积、可调孔结构、优异的化学稳定性和卓越的合成多样性而成为特别有吸引力的平台。尽管已有多种基于COFs的固定化策略被探索，但关于脂肪酶在COFs上固定化的基本问题仍未得到解答。大多数已报道的研究集中于开发新型COF-酶复合物或改善催化性能，而关于酶吸附机制的研究相对较少。特别是，系统评估COF表面化学和织构性质如何独立影响酶负载、吸附动力学和催化活性的研究仍然缺乏。此外，利用廉价、商业化可得的结构单元通过简单可规模化步骤合成COFs仍是将这些材料转化为实用生物催化技术的重要挑战。

**研究内容与结论**

为解决上述知识空白，研究人员研究了Diutina rugosa脂肪酶（DrL）在四种自制COFs（RIO-12、RIO-13、RIO-54和RIO-55）上的固定化，这些COFs由简单、商业化可得的前体合成。这些材料被特意选择以提供比表面积、孔径和表面官能团密度的系统性变化，从而能够独立评估化学组成和织构性质对酶固定化的影响。研究人员考察了吸附动力学和平衡等温线以建立COF结构与蛋白质摄取之间的关系，据研究人员所知，这是首个关于脂肪酶在COFs上的系统吸附研究。随后通过酯水解评估了所得生物催化剂的催化性能，从而阐明了酶吸附与催化活性之间的关系。总体而言，该工作建立了支配脂肪酶在COFs上固定化的清晰结构-性能关系，并为合理开发低成本、可规模化且高性能的COF基生物催化剂用于工业应用提供了实用设计原则。

**关键技术方法**

研究人员采用溶剂热法合成了四种COFs（RIO-12、RIO-13、RIO-54、RIO-55），并通过粉末X射线衍射（PXRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、氮气吸附-脱附（BET法测定比表面积和孔径分布）、扫描电子显微镜（SEM）及密度泛函理论（DFT）计算对材料进行了系统表征。酶固定化通过简单的物理吸附实现，采用Bradford法进行蛋白质定量。酶活性通过4-甲基伞形酮基庚酸酯（MUF-HEPT）水解的荧光测定法评估。脂肪酶（DrL，Sigma-Aldrich，目录号L-1754）为商业化产品，无特殊样本队列来源。

**研究结果**

**COFs的合成与表征**：FTIR分析显示RIO-12和RIO-13在约1693和1596 cm^?1处出现C=N伸缩振动谱带，RIO-54和RIO-55在1627和1619 cm^?1处出现与酮-烯胺单元相关的C=O伸缩振动谱带。N₂吸附-脱附等温线表明RIO-12和RIO-13为I型微孔材料，BET比表面积分别为1164和384 m² g^?1；RIO-54和RIO-55分别为III型和具有滞后环的等温线，比表面积分别为35和280 m² g^?1。PXRD证实了框架结构的形成，RIO-54和RIO-55的低结晶性归因于构建单元的非线性和低对称性。

**DrL固定化**：在所有四种COFs上，酶负载效率高达99.8%–99.9%，蛋白质结合量约为43.935 ± 0.023 mg/g。固定化后PXRD图谱中特征反射强度略有降低，FTIR谱图未显示框架官能团的实质性变化，SEM图像显示颗粒形貌无显著改变，表明框架结构基本保持。

**吸附动力学与等温线**：在26 °C下，所有四种COFs在水相中的蛋白质浓度在前10 s内降至最终水平，表明DrL摄取极其迅速。尽管各载体比表面积和孔径差异显著，但在该时间间隔内未观察到吸附行为的明显差异，提示COF表面的有机和芳香特性而非比表面积或孔径是控制初始摄取的主要因素。吸附等温线在0.032–2.071 mg mL^?1浓度范围内呈Henry型线性关系，未观察到吸附平台，表明在实验条件下吸附容量未饱和。连续洗涤循环中酶释放量低于初始固定化酶量的0.3%，表明DrL被强效保留。

**催化性能**：游离DrL及DrL@RIO-12、DrL@RIO-13、DrL@RIO-54、DrL@RIO-55的比活性分别为27.7、408.5、235.4、93.3和24.4 U mg^?1。固定化使RIO-12、RIO-13和RIO-54上的比活性分别提高约14.8、8.5和3.4倍，而DrL@RIO-55保留了游离酶约87%的活性。活性排序（DrL@RIO-12 > DrL@RIO-13 > DrL@RIO-54 > DrL@RIO-55）与推测的疏水性顺序并不完全一致，表明疏水性 alone 不能解释活性变化的大小和方向。DrL@RIO-12的BET比表面积为828.2 m² g^?1，保留了原始RIO-12约71%的比表面积，与正向分配效应假说相容。底物吸附实验表明RIO-12可从反应介质中保留MUF-HEPT，支持COF可在界面区域富集底物的假设。

**讨论与结论**

讨论部分指出，固定化脂肪酶的表观活性不仅取决于其内在催化性质，还受传质和底物可及性影响。载体可通过与底物的相互作用影响活性：当载体优先将底物浓缩在固定化酶附近时，局部底物浓度可能高于本体溶液，这种正向分配效应可增强表观催化活性。研究人员提出两种互补效应解释DrL@RIO-12和DrL@RIO-13的活性增强：第一，这些COFs的化学异质性表面可与酶建立多种非共价相互作用，包括与芳香框架的疏水相互作用和涉及含氮、含氧基团的氢键，这些相互作用可促进强效酶保留同时有利于活性位点可及的取向或构象；第二，RIO-12的高比表面积和有序纳米孔结构可能有利于正向分配效应，将MUF-HEPT浓缩在外部固定化酶附近。结论部分翻译如下：本研究证明RIO-12、RIO-13、RIO-54和RIO-55是Diutina rugosa脂肪酶固定化的有效载体。所有四种COFs在前10 s内提供超过99%的蛋白质摄取，每个洗涤循环的酶泄漏低于0.3%，表明快速吸附和强效酶保留。尽管比表面积和孔径差异显著但摄取相似，提示COF表面的有机和芳香特性在DrL吸附中起重要作用。四种COFs中三种上的固定化增强了DrL活性，DrL@RIO-12表现出最高比活性，相对于游离酶增加14.8倍。结果提示这种增强源于有利的酶-表面相互作用、界面活化、活性位点可及性的保持以及固定化酶附近底物富集的共同作用。总体而言，快速单步固定化、高酶保留和显著的活性增强证明了疏水性COFs作为开发高活性多相生物催化剂实用载体的潜力。这些结论的范围应考虑使用单一模型底物MUF-HEPT的局限性，观察到的活性增强幅度可能取决于底物性质和反应条件，不应直接外推至天然脂质或其他转化。比较分析支持更广泛的设计原则：仅COF化学组成不足以预测催化性能，即使高效的酶摄取和强效保留也不一定转化为增强的活性，开发COF基生物催化剂时需同时考虑表面化学和织构性质。