Leydig细胞源性CTRP6–AdipoR1信号通过促进睾酮合成缓解肥胖相关雄性生殖功能障碍

《Reproductive Toxicology》：CTRP6–AdipoR1 signaling promotes testosterone production and alleviates obesity-associated male reproductive dysfunction

　　

肥胖是男性不育的重要危险因素，但肥胖与精子发生受损之间的分子机制仍不明确。本研究表明，C1q/TNF相关蛋白6（CTRP6）是Leydig细胞来源的睾酮生成调节因子，其局部表达在肥胖状态下降低。高脂饮食（HFD）喂养选择性降低Leydig细胞中CTRP6的表达与分泌，而循环CTRP6水平升高，提示睾丸微环境内存在组织特异性失调。Leydig细胞特异性CTRP6过表达可显著缓解HFD诱导的睾丸萎缩，恢复生精小管结构，改善精子参数与生殖结局，并挽救睾酮生成。相反，Leydig细胞特异性CTRP6敲除在正常饮食条件下即损害精子发生并降低雄性生殖能力，支持内源性CTRP6在生殖稳态中的重要作用。分泌、遗传及细胞外蛋白实验的综合结果与自分泌作用相符。转录组分析鉴定出CYP51A1为候选下游介质。CTRP6与脂联素受体1（AdipoR1）结合，AdipoR1敲低减弱了重组人CTRP6（rhCTRP6）相关的PI3K/Akt磷酸化、SREBP2与CYP51A1丰度、胆固醇含量及睾酮生成变化。值得注意的是，睾丸内注射rhCTRP6可在体内有效挽救HFD诱导的精子发生功能障碍。综上，这些发现揭示了一个此前未被认识的Leydig细胞源性CTRP6局部信号模型，将肥胖与雄性生殖功能障碍联系起来。

研究背景：全球肥胖患病率持续上升，肥胖已被广泛认定为男性生殖功能障碍的重要危险因素，与精子发生受损、精子质量下降及生育力低下密切相关。精子发生依赖睾丸微环境中生殖细胞与体细胞的协调互作，Leydig细胞通过合成睾酮在其中处于核心地位，睾酮对维持生精小管结构、生殖细胞发育及雄性生育力至关重要。肥胖可损害Leydig细胞类固醇生成，导致睾酮水平降低与精子发生缺陷。尽管胰岛素抵抗、炎症及脂代谢改变等系统性因素参与其中，但睾丸内局部调控因子的作用日益受到关注。C1q/TNF相关蛋白（CTRP）家族为分泌型脂联素相关蛋白，参与代谢调节、炎症及内分泌信号，部分成员（如CTRP3、CTRP9）在睾丸功能中的作用已有探索，但CTRP6在雄性生殖系统中的作用尚不清楚：其是否在睾丸局部产生、肥胖如何影响其睾丸表达、能否直接调控Leydig细胞功能，以及介导其作用的受体与胞内信号通路均属未知。基于此，研究人员开展本研究。

研究开展与结论：研究人员鉴定Leydig细胞源性CTRP6为肥胖条件下睾酮合成与精子发生的关键调节因子。HFD喂养选择性降低Leydig细胞中CTRP6表达与分泌，而循环CTRP6水平升高，提示组织特异性失调。借助Leydig细胞特异性功能获得与缺失小鼠模型，研究人员证明CTRP6在正常饮食与HFD条件下均参与类固醇生成能力、生精完整性与雄性生殖功能。机制上，研究人员发现CTRP6与AdipoR1结合，并存在依赖AdipoR1的PI3K/Akt磷酸化、SREBP2/CYP51A1丰度、胆固醇含量及睾酮生成反应。睾丸内给予rhCTRP6可在体内有效挽救HFD诱导的精子发生功能障碍。该研究揭示了一条此前未被认识的代谢–生殖调控通路，并将CTRP6确定为肥胖相关雄性生殖功能障碍的潜在治疗靶点。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用C57BL/6 J野生型小鼠、ob/ob小鼠及条件性CTRP6过表达与敲除小鼠模型（购自Cyagen Bioscience Inc.，广州；Cre工具鼠购自The Jackson Laboratory），通过Leydig细胞、脂肪细胞及Sertoli细胞特异性过表达模型与Leydig细胞特异性敲除模型进行体内功能研究；采用原代细胞分离培养与棕榈酸（PA）脂毒性处理结合rhCTRP6及CTRP6中和抗体干预进行体外验证；采用RNA测序与KEGG通路富集分析筛选下游介质；采用定量蛋白质组学（LC–MS/MS）筛选受体、免疫共沉淀（Co-IP）验证相互作用并进行分子对接；采用睾丸内注射rhCTRP6进行体内挽救实验，并结合睾丸组织病理形态学、精子参数分析与生育力评估。

研究结果：

2.1 CTRP6在HFD喂养雄性小鼠睾丸中降低且主要由Leydig细胞分泌：研究人员检测正常饮食（ND）与HFD小鼠及野生型与ob/ob小鼠睾丸中五种代谢相关CTRP蛋白，发现CTRP3与CTRP6在两种肥胖模型睾丸中均显著降低；PA处理原代Leydig细胞选择性降低CTRP6表达。HFD小鼠血浆CTRP6升高而睾丸CTRP6显著降低，提示睾丸微环境内组织特异性调控。细胞来源分析显示Leydig细胞基础表达最高，HFD小鼠Leydig细胞中CTRP6 mRNA与蛋白显著降低；脂肪细胞分泌CTRP6最多，Leydig细胞亦分泌可观量，HFD增加脂肪细胞分泌但显著抑制Leydig细胞分泌，PA处理同样抑制Leydig细胞CTRP6分泌，表明富脂环境直接损害Leydig细胞的CTRP6产生。

2.2 Leydig细胞特异性CTRP6过表达改善HFD诱导的精子发生功能障碍：研究人员构建CTRP6 lTg小鼠，其睾丸CTRP6显著升高而循环水平不变。HFD条件下，CTRP6 lTg小鼠睾丸重量/胫骨长度比值显著高于对照，生精小管结构得以保留、管径增大、上皮厚度恢复；精子数量、活力与运动性下降显著逆转；生育力实验显示交配结局改善；类固醇生成标志物StAR、P450scc与3β-HSD表达及血清睾酮水平恢复。脂肪细胞特异性（CTRP6 aTg）与Sertoli细胞特异性（CTRP6 sTg）过表达模型在HFD条件下未改善睾丸组织学、精子参数或睾酮水平，支持局部Leydig细胞来源的重要性。

2.3 Leydig细胞特异性CTRP6敲除损害精子发生并降低雄性生殖能力：研究人员构建CTRP6 cKO小鼠并经Western blot与qPCR确认睾丸CTRP6显著降低。即使在生理条件下，CTRP6 cKO小鼠即表现明显睾丸病理改变，包括生精小管结构紊乱、睾丸重量/胫骨长度比值降低、管径减小及生精上皮变薄；精子数量、活力与运动性显著降低；类固醇生成标志物表达与血清睾酮浓度下降；生育力实验显示生殖能力明显下降。上述结果支持Leydig细胞源性CTRP6对正常精子发生与雄性生殖功能的重要贡献。

2.4 细胞外CTRP6增强Leydig细胞睾酮生成：体外挽救实验中，PA损害精子活力与运动性并降低Sertoli细胞活力，但rhCTRP6在测试条件下对这些指标无明显作用，亦未改变Sertoli细胞紧密连接蛋白ZO-1与occludin表达；而rhCTRP6显著逆转PA对原代Leydig细胞睾酮生成的抑制。进一步实验显示，PA降低Leydig细胞内cAMP水平、PKA活性、睾酮浓度及关键类固醇生成标志物表达，rhCTRP6可恢复上述指标，而CTRP6中和抗体则将其消除，表明Leydig细胞对细胞外rhCTRP6的反应依赖CTRP6；结合CTRP6主要由Leydig细胞分泌，提示其以自分泌方式发挥作用。

2.5 CTRP6与CYP51A1上调及固醇生物合成特征相关：研究人员对CTRP6过表达TM3细胞（cTM3）与对照细胞进行RNA测序，差异表达基因聚类可将两组分开，共鉴定270个上调与493个下调基因；KEGG富集分析显示类固醇生物合成为显著改变的途径之一，与CTRP6对睾酮生成的作用一致。该通路中CYP51A1表达变化最为显著之一，蛋白–蛋白互作网络分析显示CYP51A1为固醇生物合成网络的中心节点，提示其为CTRP6相关固醇生物合成反应的候选下游介质。

2.6 CTRP6在Leydig细胞中引发依赖AdipoR1的PI3K/Akt–SREBP2–CYP51A1反应：定量LC–MS/MS分析显示，前五位候选互作蛋白中AdipoR1是唯一已知膜受体；TM3细胞裂解物Co-IP支持CTRP6与AdipoR1的内源性结合，Flag-CTRP6与His-AdipoR1共转染HEK293T细胞支持外源性结合，蛋白对接提供了结构假设。原代Leydig细胞中，PA显著降低p-PI3K、p-Akt水平及SREBP2/CYP51A1丰度，rhCTRP6减轻上述降低，而AdipoR1敲低削弱该反应；相同处理下细胞胆固醇含量、类固醇生成标志物（StAR与3β-HSD）及睾酮浓度呈一致趋势，支持依赖AdipoR1的rhCTRP6反应与PI3K/Akt磷酸化、SREBP2/CYP51A1丰度、胆固醇含量及睾酮生成相关。

2.7 rhCTRP6缓解HFD诱导的精子发生功能障碍并与类固醇生成信号恢复相关：研究人员经睾丸内注射给予HFD小鼠rhCTRP6。HFD显著降低睾丸重量/胫骨长度比值，rhCTRP6使其恢复至接近正常；组织学显示rhCTRP6明显减轻HFD诱导的生精小管结构破坏，改善管径与上皮厚度；精子参数显著改善；生育力实验显示妊娠率提高、胚胎吸收减少。分子水平上，HFD降低p-PI3K、p-Akt水平及SREBP2/CYP51A1丰度，伴睾丸胆固醇含量与睾酮生成降低，rhCTRP6逆转这些改变并增加类固醇生成标志物表达。

讨论部分总结：肥胖相关男性生育力低下日益普遍，但将系统性代谢失调转化为局部睾丸内分泌衰竭的分子 relay 尚未完全阐明。Leydig细胞类固醇生成受损导致睾酮缺乏、破坏生精小管结构并损害生殖细胞发育，是各实验模型的一致病理特征。本研究支持一条在HFD条件下选择性受损、对稳健睾酮合成与生精输出重要的Leydig细胞自分泌CTRP6通路，将CTRP6定位为生理与肥胖状态下生殖能力的局部决定因素。与既往CCL2、Sertoli细胞NLRP3–IL-1β等研究相比，本研究最显著发现之一是HFD小鼠循环与睾丸CTRP6水平的分离：血浆CTRP6升高而Leydig细胞表达与分泌选择性降低，提示肥胖诱导局部内分泌功能障碍而非均一的系统性效应，也说明系统性脂联素测量难以预测生殖内分泌状态。功能获得与缺失实验表明Leydig细胞源性CTRP6对维持精子发生与雄性生育力重要，脂肪细胞或Sertoli细胞靶向过表达不能重现其益处，而Leydig细胞特异性缺失即使在生理条件下即导致类固醇生成受损、精子发生缺陷与生育力下降，且敲除雄鼠仍保留精子生成与致孕能力，提示为生育力低下而非完全不育。AdipoR1作为赋予CTRP6信号特异性的关键受体节点，经典上为脂联素受体，睾丸中已有表达报道，但其作为Leydig细胞信号枢纽的机制定位尚不充分；本研究将其鉴定为CTRP6在睾丸中的功能性受体，并阐明其连接睾酮合成的下游机制。既往研究常将Leydig细胞AdipoR1激活描述为经AMPK相关通路抑制类固醇生成，而近期证据显示其作用高度依赖背景，提示AdipoR1为多效性受体平台，通路选择随激动剂身份与细胞代谢状态而变，符合偏向性信号概念：在肥胖所致脂毒性应激下，CTRP6作为局部配体诱导AdipoR1偏向促类固醇生成通路（如PI3K/Akt）。AdipoR1–PI3K/Akt轴是CTRP6在代谢失调下恢复类固醇生成能力的主要 conduit，PI3K/Akt激活与睾酮合成增强及雄激素缺乏缓解直接相关，且该轴在更广泛生精生态系统中调控精原干细胞自我更新与生殖细胞发育。rhCTRP6虽未显著改善PA挑战下所检测的精子或Sertoli细胞终点，但其恢复Leydig细胞PI3K/Akt活性与睾酮输出的能力可能经内分泌与旁分泌途径稳定睾丸微环境。PA处理精子与Sertoli细胞实验属生物学上不同的系统，应分别解读：成熟精子运动性对孵育介质、能量底物、时间、温度、物种及脂肪酸浓度高度敏感，故PA诱导的小鼠精子活力与运动性损害仅应在本研究限定的小鼠精子孵育条件下解读；Sertoli细胞实验旨在评估分离Sertoli细胞对脂毒性应激的反应，rhCTRP6未挽救支持以Leydig细胞为中心的间接机制。机制上，本研究将CTRP6介导的AdipoR1–PI3K/Akt轴激活鉴定为调控CTRP6恢复类固醇合成能力的关键阀门，并将CYP51A1指定为其关键下游效应分子。胆固醇为所有类固醇激素前体，其用于类固醇生成的可用性可限制睾酮合成能力；Leydig细胞胆固醇降低是睾酮缺乏的核心因素，抑制PI3K/Akt可降低SREBP2激活并破坏胆固醇合成。研究人员观察到CTRP6逆转HFD/PA相关的PI3K/Akt激活降低及SREBP2与CYP51A1表达下降，同时恢复胆固醇含量与睾酮生成。通过增强从头胆固醇合成挽救Leydig细胞功能的策略已被证明可有效提高睾酮生成，具有显著治疗潜力，故研究人员提出CTRP6–AdipoR1驱动的增强胆固醇供应程序对代谢紊乱下恢复Leydig细胞功能至关重要。本研究观察到的胆固醇生物合成调节因子表达降低与其他报道的睾丸脂质蓄积之间的表观差异，需考虑胆固醇区室化与实验背景：Sun等（2026）报道尽管睾酮生成降低，总睾丸胆固醇与间质脂滴蓄积升高，并伴Leydig细胞线粒体–内质网通讯受损，提示储存池中过量胆固醇未必反映用于类固醇生成的胆固醇可用性增加；动员、细胞器转运或利用受损可与SREBP2–CYP51A1相关生物合成程序受抑并存。Funes等（2021）在非肥胖高胆固醇血症兔模型中报道睾丸SREBP2信号呈持续时间依赖性变化，提示比较这些发现时应考虑物种、暴露时长与代谢背景。与Sun等强调的脂滴–细胞器机制相比，本研究提示局部CTRP6–AdipoR1信号与SREBP2–CYP51A1调控相关的互补缺陷，二者是否相互作用尚待解决；本研究结果与CTRP6恢复胆固醇生物合成/类固醇生成程序相符，而非全局正常化胆固醇代谢。重要的是，胆固醇检测测定的是含量而非从头合成通量，故现有数据不能确立CTRP6直接纠正胆固醇摄取、酯化、脂滴蓄积或线粒体胆固醇转运；合成通量与亚细胞胆固醇池的测定将有助于确定该通路变化与胆固醇可用性及睾酮生成的关系。研究局限包括：睾丸内给予rhCTRP6虽显示治疗潜力但临床应用受限，未来应探索替代递送策略或靶向CTRP6–AdipoR1–PI3K/Akt轴的小分子调节剂；虽数据强烈支持Leydig细胞内自分泌机制，但不能完全排除CTRP6信号与其他系统性代谢激素的交互；AdipoR1与PI3K/Akt偶联的分子事件及下游效应分子的详细调控仍未完全明确；H&E形态计量与体外PA挑战模型存在固有局限，H&E不能分辨间质区室细胞组成，PA处理精子实验不能涵盖精子成熟、储存及物种特异性代谢调控的全部复杂性；尽管以盲法评估近似圆形横断面小管轮廓并优先选择形态可识别的VII–VIII期小管，该方法不能建立全面的分期匹配。未来结合细胞类型特异性间质标志物、原代Sertoli细胞或体内分析及优化精子培养系统可进一步完善结论。

研究结论翻译：综上，本研究将CTRP6鉴定为此前未被认识的睾酮合成与精子发生局部调节因子。通过将肥胖诱导的代谢应激经AdipoR1–PI3K/Akt–SREBP2–CYP51A1轴与睾酮生物合成受损相联系，研究结果为肥胖相关雄性生殖功能障碍提供了新的机制见解。这些结果不仅推进了对睾丸内分泌调控的理解，也提示了治疗肥胖相关男性生育力低下的新途径。