以尿酸（UA）作为天然氧化还原活性分子的多壁碳纳米管/碳浆修饰石墨片电极用于适配体介导的信号转导

《Electroanalysis》：Multiwalled Carbon Nanotube/Carbon Paste-Modified Graphite Sheet Electrode Using Uric Acid as a Naturally Occurring Redox-Active Molecule for Aptamer-Mediated Signal Transduction

　　

本研究考察了尿酸（UA）——一种天然存在的氧化还原活性分子——作为报告分子用于适配体介导的电化学信号转导。研究人员比较了五种石墨片电极构型，其中多壁碳纳米管/碳浆修饰石墨片电极（MWCNT/CP/GSE）对UA的总体响应最强。实测UA线性范围为50–1000 μM，基于空白计算的检出限为0.26 μM，定量限为0.87 μM。标准氧化还原探针循环伏安法（CV）与电化学阻抗谱，连同不含纳米管的CV处理对照，为修饰顺序所致变化提供了互补证据。同一MWCNT/CP/GSE电极上连续四次UA测量未出现递进式电流损失，而三支独立制备电极的器件间相对标准偏差为9.2%。使用T5睾酮结合适配体时，UA氧化电流在所测试的100–700 nM睾酮区间内下降。额外的皮质醇、雌二醇与孕酮时间进程对照在所测试条件下未显示可比的递进式衰减。在400 nM睾酮下，50、100与200 μM UA背景中的平均峰电流保留率为78.83%–82.34%。这些结果支持在受控模型体系中UA介导的信号转导，并显示在所测试UA背景间量级相近的归一化响应。本研究在缓冲液中建立了概念验证；生理性睾酮灵敏度与汗液中的定量性能尚待确立。

研究背景方面，尿酸（UA）是嘌呤代谢的氧化还原活性终产物，其体液浓度可反映代谢状态，异常UA水平与痛风、高血压、心血管疾病及代谢综合征等相关，且UA已在汗液中被测定。除作为临床相关代谢物外，UA在生物体液中天然存在、在碳基电极上具有明确的氧化行为，因而适合用于电化学传感。电化学方法相较分光光度法、高效液相色谱（HPLC）与毛细管电泳在简便性、快速响应及与小型化传感器格式的兼容性方面具有优势；非酶电化学传感器通过电极表面修饰而非酶介导识别，可提供更好的稳定性、更简单的制备与更低的成本。已有大量纳米材料被用于增强非酶UA传感器的电催化响应，包括PEDOT、镍六氰基铁酸盐纳米颗粒、有机黏土膜、金纳米颗粒与β-环糊精–石墨烯复合物、MWCNT与介孔石墨烯泡沫、MoS₂纳米花–石墨烯/ITO电极等。但现有研究多聚焦于UA的直接定量，尚缺乏将天然氧化还原活性分子作为报告分子、与分子识别元件耦合以检测其他靶标（如激素）的系统评估；同时，电极构型的简化制备与实际响应之间的关系仍需明确。基于此，研究人员以睾酮作为模型靶标，考察以UA作为适配体介导转导信号来源的可行性，并明确其定位为信号转导概念验证而非生理性睾酮监测。

研究人员开展了以下工作：比较裸石墨片电极（GSE）、碳浆（CP）/GSE、石墨油墨（GI）/GSE、MWCNT/GI/GSE与MWCNT/CP/GSE五种构型，以筛选能产生可用UA报告电流的简易碳电极构型；工作电极制备使用商用碳材料与xurography切割，不涉及贵金属纳米颗粒合成。除UA响应外，采用标准探针CV、电化学阻抗谱（EIS）以及经去离子水CV处理的CP/GSE对照考察修饰顺序的影响；随后以T5睾酮结合适配体作为模型识别元件，评估UA电流调制、序列依赖性、对结构相关甾体的响应以及UA背景浓度的影响。研究得出的结论是：MWCNT/CP/GSE提供最强的总体UA响应，实测线性范围50–1000 μM，计算检出限与定量限分别为0.26与0.87 μM；CV处理于MWCNT悬液较水CV对照产生更高平均UA峰电流，支持MWCNT相关处理的额外贡献；MWCNT/CP/GSE阻抗低于CP/GSE，但裸GSE在探针测试中阻抗最低，故不支持普适的电荷转移电阻逐级下降或电活性面积的数值指认。四项连续测量显示无递进式衰减，器件间RSD为9.2%，单器件28天观察响应相对稳定。T5适配体修饰电极在100–700 nM睾酮区间呈现UA报告电流的浓度依赖性衰减，乱序DNA与结构相关甾体对照支持优先的T5/睾酮相关信号调制；在400 nM睾酮下，50–200 μM UA背景的归一化衰减约为18%–21%。其重要意义在于，该研究以实验评估的信号转导策略为贡献，而非宣称作为完全验证的激素测定方法更优；结果为以天然氧化还原活性分子作为适配体界面报告分子提供了概念验证，并为未来汗液分析应用奠定界面研究基础。

关键技术方法方面（不超过250字）：采用xurography切割商用石墨片制备三电极器件，以碳浆为中间涂层并经CV电沉积羧基化MWCNT构建工作电极；通过EDC–NHS偶联将5′-胺修饰T5适配体共价固定于MWCNT表面；以差分脉冲伏安法（DPV）与计时电流法（CA）进行UA定量与报告电流测量，并以铁/亚铁氰化物标准探针CV与EIS表征界面；设置独立电极组CV处理对照、乱序DNA对照及皮质醇、雌二醇、孕酮时间进程对照。研究所用适配体为商业合成，未涉及样本队列来源。

研究结果方面，3.1 电化学机制：UA在工作电极氧化产生随浓度增加的DPV峰，该峰既作为UA表征的分析信号，也作为适配体实验的报告电流；MWCNT界面的电活性面积、界面动力学、涂层电阻与传质贡献需分别讨论，故对CV、EIS与UA对照响应分别论述。3.2 表面形貌与电化学表征：铁/亚铁氰化物探针CV显示电流响应按GSE<CP/GSE<MWCNT/CP/GSE递增且峰分离减小，但MWCNT/CP/GSE较宽电流包络含显著背景贡献，未将CV环面积等同于电活性面积；Nyquist图显示裸GSE阻抗最低、CP/GSE最高、MWCNT/CP/GSE居中，修饰顺序未产生自裸GSE起的单调阻抗下降；DPV结果表明CP涂层改善石墨片表面响应，GI/GSE在所测范围内缺乏明显浓度依赖峰；独立组对照中200 μM UA峰电流为CP/GSE 19.75±1.18 μA、水CV处理后20.59±1.64 μA、MWCNT悬液CV处理后32.78±2.24 μA，水CV较未处理高约4.2%，MWCNT悬液CV较水CV对照高约59.2%；SEM提供表面形貌的定性背景，未证实均一MWCNT覆盖或电活性面积定量增加。3.3 CA结果：CA在50–2000 μM范围内随逐步加入UA电流上升，为DPV校准提供补充读出。3.4 UA校准与计算检出限：MWCNT/CP/GSE线性范围50–1000 μM，斜率0.19364 μA μM^?1，空白标准差0.01689832 μA，计算检出限0.262 μM、定量限0.873 μM；裸GSE、CP/GSE、MWCNT/GI/GSE的检出限分别为9.4、0.456、0.594 μM，GI/GSE因无线性响应被排除；2000 μM点偏离线性趋势被排除于回归；空白衍生检出限低于最低非零标准，故不能确立50 μM以下的回收率或定量准确度。3.5 干扰实验：在60 μM UA中分别加入25 μM AA、125 μM尿素、125 μM葡萄糖、1 mM乳酸与10 μM DA，UA-only平均峰电流5.56±0.75 μA，各加入条件分别为5.93±0.34、5.62±0.44、5.79±0.64、6.07±0.98与5.49±0.36 μA，变化为+6.66%、+1.12%、+4.15%、+9.28%与?1.10%；Welch方差分析未检出组间总体差异（F(5, 11.01)=0.796，p=0.574），Holm校正后各比较均不显著，但该结果不确立等效性或完全无干扰；单传感器BSA比较中，0.05与0.10 mg/mL BSA使平均峰电流分别降低4.64%与5.86%，该设计不能将BSA效应与测量历史、漂移或残留效应区分。3.6 重现性与长期稳定性：三支独立制备传感器在200 μM UA中平均峰电流为33.00、30.43与36.54 μA，总体均值33.32 μA，器件间RSD 9.2%，器件内标准差低于1.1 μA；单支传感器28天内首末七日平均电流相差约1 μA、峰电流变化低于3 μA；同一电极四次连续测量峰电流为33.2893、33.3039、33.6061与33.6629 μA，均值33.4656 μA，标准差0.1965 μA，RSD 0.59%，第四与第一次电流比为101.12%，未见递进式损失。3.7 适配体介导信号转导概念验证：T5适配体经EDC–NHS共价固定，提出无靶标时适配体允许较大UA接近界面、睾酮结合改变适配体层构象与界面组织从而部分阻碍UA接近与电子转移的信号关闭机制；DPV在约+0.32 V处UA氧化峰由0 nM的35.10±0.19 μA降至700 nM的23.62±0.33 μA；ΔI在100–700 nM分别为4.44±0.13、5.25±0.14、6.43±0.23、7.13±0.24、8.22±0.24、9.81±0.30与11.48±0.33 μA，线性拟合ΔI(μA)=0.01144×睾酮+2.961，R²=0.980，0 nM点未纳入拟合，且因未测100 nM以下浓度、回归不过空白，未外推指定睾酮检出限或定量限；乱序DNA对照变化远小于T5，支持序列依赖性调制；皮质醇、雌二醇与孕酮在700 nM下的单电极时间进程显示轻微波动而无与睾酮可比的递进式衰减，提供定性支持但不量化交叉反应系数。3.8 UA背景对归一化响应的影响：在50、100与200 μM UA下比较400 nM睾酮暴露前后峰电流，平均保留率分别为78.83±1.83%、82.34±3.44%与79.77±3.02%，相应衰减为21.17±1.83%、17.66±3.44%与20.23±3.02%；固定睾酮浓度在三种UA背景下引起量级相近的归一化响应，支持采用电极内归一化，但未做等效性检验。3.9 与相关平台比较：已发表睾酮适配体传感器采用竞争电化学发光、水凝胶/金纳米颗粒印刷电极、适配体/金/MOF/离子液体碳浆等不同架构并具不同程度的分析验证；柔性MWCNT/β-环糊精/rGO凝胶电极已实现运动诱导汗液中DA/UA同时检测；本研究缺少回收率数据、9.2%器件间RSD与单器件储存测试限制了分析就绪性主张，制造简便性应与缺失的验证并列讨论而非替代之。

讨论与结论部分总结：研究比较五种碳电极构型，MWCNT/CP/GSE提供最强总体UA响应；匹配CV程序的独立电极组比较连同标准探针CV与EIS提供互补信息；MWCNT悬液CV处理较水CV对照产生更高平均UA峰电流，支持MWCNT相关处理的额外贡献；MWCNT/CP/GSE阻抗低于CP/GSE，而裸GSE在探针测试中阻抗最低，这些观察不支持普适的电荷转移电阻逐级下降或电活性面积数值指认。MWCNT/CP/GSE实测线性UA响应为50–1000 μM，计算空白衍生检出限与定量限为0.26与0.87 μM，2000 μM点在线性范围之外；单传感器BSA比较中0.05与0.10 mg/mL BSA接触5 min后平均UA电流分别低4.64%与5.86%；同一电极四次连续测量无递进式衰减；三支独立制备电极器件间RSD为9.2%，单支电极28天观察期内响应相对稳定，这些结果限于所述实验规模。T5适配体功能化MWCNT/CP/GSE在100–700 nM睾酮区间呈现UA报告电流的浓度依赖性衰减，乱序DNA与结构相关甾体对照支持优先的T5/睾酮相关信号调制解释；400 nM睾酮下50–200 μM UA背景的归一化衰减约18%–21%。结论译文：这些结果强化了以天然存在的氧化还原活性分子作为适配体界面报告分子的概念验证。应用于汗液分析将需要验证生理浓度下的睾酮灵敏度、回收率、更广泛的蛋白/基质兼容性（包括适配体界面）以及多器件储存稳健性。