《Brazilian Journal of Microbiology》：In vitro antifungal activity and preliminary physicochemical stability of a shampoo containing a hexane extract from Agave sisalana residues
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本研究评估了从Agave sisalana残渣中获得的己烷提取物（HES）的体外抗真菌活性，以及含HES洗发剂的初步理化稳定性。测定了HES和酮康唑对Malassezia pachydermatis ATCC 14,522和Trichophyton rubru
本研究评估了从Agave sisalana残渣中获得的己烷提取物（HES）的体外抗真菌活性，以及含HES洗发剂的初步理化稳定性。测定了HES和酮康唑对Malassezia pachydermatis ATCC 14,522和Trichophyton rubrum ATCC 28,189的最低抑菌浓度（MICs）。随后通过接触30、60和90分钟后的活菌计数试验评估了含HES洗发剂对T. rubrum的抗真菌活性。在30天稳定性研究期间，还监测了制剂的 appearance、气味、均匀性、pH和黏度。HES对M. pachydermatis和T. rubrum的MICs分别为125 μg mL?1和750 μg mL?1，而酮康唑的相应MICs分别为112.5和900 μg mL?1。在所有评估的接触时间点，含HES洗发剂产生的菌落形成单位计数显著低于洗发剂基质（p < 0.001）。含HES洗发剂与含酮康唑洗发剂之间未检测到统计学显著差异（p = 0.564）；然而，该发现未被解释为统计学等效性的证据。在整个30天评估期间，未观察到外观、气味或均匀性的变化。在评估的储存条件下，pH保持约6.0，而在25 °C下黏度保持约3000 cP。这些发现支持HES的体外抗真菌活性，并 warrant 对该制剂的进一步研究，包括提取物的化学表征、安全性评估和长期稳定性研究。
研究背景方面，巴西是Agave sisalana（剑麻）硬纤维的主要生产国，纤维仅占鲜叶质量的约5%，其余材料构成农工业残渣，常被丢弃于产区。从该残渣中回收生物活性化合物有助于其增值化并支持循环生物经济发展策略。A. sisalana的植物化学研究已报道不同植物来源组分中存在甾体皂苷和皂苷元，这些化合物类别与包括抗真菌在内的多种生物活性相关。然而，植物提取物的组成和生物活性取决于原料和提取条件，因此特定组分的抗真菌活性在没有适当化学表征的情况下不能归因于皂苷或任何其他化学类别。皮肤癣菌病是累及角化组织（包括皮肤、毛发和甲）的浅表真菌感染。Trichophyton rubrum是最流行的亲人性皮肤癣菌之一，也是巴西和全球人类皮肤癣菌病的重要病原体。相比之下，Malassezia pachydermatis是动物皮肤和黏膜表面的共生酵母，尤其在犬中，但在有利条件下其过度增殖可能与皮炎和耳炎相关。这些微生物在形态学、生理学、营养需求和抗真菌药物敏感性方面存在差异，使其成为抗真菌活性初步评估的相关模型。浅表真菌感染的管理可能需要长期局部或全身治疗。复发、治疗失败和抗真菌耐药性的出现增加了对具有抗皮肤癣菌和机会性酵母活性化合物的鉴定兴趣。因此，植物来源提取物和分离的天然化合物已被研究作为具有不同化学结构和潜在作用机制的抗真菌药物来源。然而，体外证明的抗真菌活性并不确立临床疗效或安全性，应被视为候选物质评估的初始步骤。先前研究证明了从A. sisalana残渣获得的水提物对Candida albicans和M. pachydermatis的抗真菌活性。然而，从该残渣获得的低极性组分及其掺入局部制剂的抗真菌活性仍未充分研究。己烷分配提供了富含对有机相具有更大亲和力化合物的组分，尽管需要化学表征以确定其实际组成。此外，将植物来源提取物掺入洗发剂需要评估其抗真菌活性在掺入制剂后是否保留，以及制剂在储存期间是否维持其理化特性。因此，本研究旨在从A. sisalana残渣中获得己烷提取物（HES）并测定其对M. pachydermatis和T. rubrum的体外抗真菌活性。随后配制了含HES洗发剂，并评估了其对T. rubrum的体外抗真菌活性以及30天内的初步感官和理化稳定性。
研究人员开展的研究包括：从巴西巴伊亚州Valente市农村生产者处获得剑麻叶片脱纤维过程中产生的残渣，经机械压榨获得剑麻汁液，过滤、离心、干燥获得沉淀物，以10.0 g/100 mL比例分散于含2%（v/v）Tween 80的蒸馏水中，加入等体积分析级己烷，振荡90分钟单次提取，8 °C静置24小时分相，己烷相减压浓缩后45 °C干燥至恒重获得HES。100 g剑麻汁液产出3.14 g干燥沉淀物，进而获得1.72 g HES，提取率相对于初始剑麻汁液质量为1.72%（w/w），相对于干燥沉淀物的回收率为54.8%（w/w）。研究得出HES对M. pachydermatis和T. rubrum的MICs分别为125和750 μg mL
?1，酮康唑相应MICs为112.5和900 μg mL
?1。含HES洗发剂产生的T. rubrum菌落形成单位计数显著低于洗发剂基质（p < 0.001），含HES与含酮康唑洗发剂之间未检测到统计学显著差异（p = 0.564），但该发现未被解释为统计学等效性证据。30天评估期间未观察到外观、气味或均匀性变化，pH保持约6.0，25 °C下黏度保持约3000 cP。这些发现支持HES的体外抗真菌活性，并 warrant 进一步研究该制剂，包括提取物的化学表征、安全性评估和长期稳定性研究。重要意义在于从A. sisalana残渣中回收生物活性化合物有助于其增值化并支持循环生物经济发展策略，同时为开发含植物来源提取物的抗真菌洗发剂提供了初步实验依据。
关键技术方法方面，研究人员采用机械压榨法从剑麻叶片脱纤维残渣中获得汁液，经过滤、离心（约2,580 ×g，20分钟，18 °C）和50 °C强制通风烘箱干燥获得沉淀物；以Tween 80为分散剂将干燥沉淀物分散于水相后，采用己烷液-液分配（1:1体积比，振荡90分钟，8 °C静置24小时）获得HES；采用肉汤宏稀释法测定HES和酮康唑对M. pachydermatis ATCC 14,522和T. rubrum ATCC 28,189的最低抑菌浓度（MIC）；通过活菌计数试验评估含HES洗发剂对T. rubrum在30、60和90分钟接触后的抗真菌活性；对含HES洗发剂进行30天初步理化稳定性评估，包括感官特性（外观、颜色、气味、均匀性、相分离）、pH和黏度（旋转黏度计，Brookfield Programmable DV-II+ Viscometer）测定。样本队列来源为巴西巴伊亚州Valente市农村生产者提供的剑麻脱纤维残渣，植物物种经S?o Paulo State University（UNESP）Assisense植物标本馆鉴定为Agave sisalana Perrine，凭证标本编号2597。真菌菌株购自Tropical Culture Collection – André Tosello Foundation（Campinas, S?o Paulo, Brazil）。
研究结果方面，抗真菌活性测定结果显示，HES在125至500 μg mL
?1终浓度范围内完全抑制M. pachydermatis可见生长，MIC为125 μg mL
?1；酮康唑在112.5至1,800 μg mL
?1范围内完全抑制可见生长，MIC为112.5 μg mL
?1。对T. rubrum，HES在750和1,500 μg mL
?1浓度下完全抑制可见生长，MIC为750 μg mL
?1；酮康唑在900和1,800 μg mL
?1下完全抑制可见生长，MIC为900 μg mL
?1。因此在实验条件下，抑制T. rubrum可见生长所需的HES和酮康唑浓度均高于M. pachydermatis，结果在三次独立实验中一致。含HES洗发剂抗真菌活性评估显示，双因素方差分析（ANOVA）揭示处理效应显著（F(2, 18) = 21.38，p < 0.001，偏η2 = 0.70），未检测到接触时间显著效应（p = 0.474）或处理×接触时间交互作用（p = 0.694）。Tukey HSD检验显示洗发剂基质产生的CFU计数显著高于含酮康唑洗发剂和含HES洗发剂（两者比较p < 0.001），含酮康唑与含HES洗发剂之间未检测到统计学显著差异（p = 0.564）。描述性统计上，含HES和含酮康唑制剂在所有评估接触时间点的平均CFU计数均低于洗发剂基质。含HES洗发剂初步稳定性评估显示，在30天初步稳定性研究期间，储存在4、25或40 °C的含HES洗发剂未观察到颜色、气味或均匀性的可见变化，三种储存条件下pH值在整个评估期间保持接近6.0，25 °C下测量的黏度在研究期间也保持接近3,000 cP，总体而言30天研究期间评估的感官和理化参数未检测到明显变化。
讨论部分总结：在本研究中，HES抑制了两种评估真菌的可见生长，对M. pachydermatis和T. rubrum的MIC值分别为125和750 μg mL
?1，相同实验条件下酮康唑的MIC值分别为112.5和900 μg mL
?1。抑制T. rubrum所需较高浓度表明该微生物在本研究条件下对两种处理的敏感性低于M. pachydermatis，然而HES与酮康唑MIC值之间的数值接近不应被解释为治疗等效性的证据。根据Fernandez-Andrade等提出的解释标准，MIC值高达0.5 mg mL
?1的天然产物被归类为强抑制剂，0.6至1.5 mg mL
?1为中等抑制剂，大于1.6 mg mL
?1为弱抑制剂，据此HES可被归类为M. pachydermatis的强抑制剂和T. rubrum的中等抑制剂，这些分类为描述性而非标准化临床敏感性折点。先前研究报道了Agave物种提取物抗真菌活性的显著变异，Hammuel等报道A. sisalana甲醇提取物对M. pachydermatis的MIC大于20,000 μg mL
?1，Verástegui等报道其他Agave物种提取物对Microsporum gypseum、Trichophyton tonsurans和Sporothrix schenckii的MIC范围为2,000至6,000 μg mL
?1，Costa等报道A. sisalana水提物对Candida albicans和M. pachydermatis的抑制浓度分别为87和1,400 μg mL
?1。由于植物物种、植物材料、提取程序、真菌菌株、接种物浓度、培养基和终点判定方法的差异可显著影响所测抗真菌活性，这些研究之间的直接比较应谨慎进行。甾体皂苷和富含皂苷的组分先前已在A. sisalana残渣中被鉴定，植物来源皂苷已证明具有抗真菌活性，这与和真菌膜甾醇相互作用及随之的膜完整性丧失相关。然而本研究中未测定HES的化学组成，因此观察到的抗真菌活性不能具体归因于皂苷或任何其他化学类别，负责该作用的化合物仍有待鉴定。将HES掺入洗发剂基质使得其抗T. rubrum活性可在配制产品中评估，该皮肤癣菌是人类浅表真菌感染的重要病原体。洗发剂基质产生的CFU计数显著高于含HES和含酮康唑洗发剂，证明总体处理效应。未检测到接触时间或处理×接触时间交互作用的显著效应，表明实验未证明30至90分钟之间CFU计数的Time-dependent变化。尽管含HES与含酮康唑洗发剂之间未检测到统计学显著差异，但该结果仅表明在所采用条件和样本量下未检测到差异，并不确立制剂间的统计学等效性，因为研究并非设计为等效性或非劣效性试验，因此发现应被解释为含HES制剂在所评估实验条件下体外抗真菌活性的证据。在30天初步稳定性研究期间，未观察到颜色、气味、均匀性、pH或黏度的明显变化，所有储存温度下pH保持接近6.0，25 °C下测量的黏度保持接近3,000 cP，这些发现表明所评估的感官和理化参数在研究期间保持相对不变。然而，短评估期并不确立制剂的长期稳定性或货架期，此外仅维持pH和黏度并不证明局部应用的皮肤耐受性或安全性。本研究存在额外局限性：HES未经化学表征，每种真菌物种仅评估一株参考菌株；MIC通过可见生长缺失确定，未测定最低杀真菌浓度，因此结果不能区分抑真菌和杀真菌效果；洗发剂试验仅限于T. rubrum，未进行细胞毒性、皮肤刺激性、渗透性、体内或临床评估，因此发现并不确立临床疗效或安全性。未来研究应包括HES的色谱和光谱表征、对更广泛参考和临床真菌菌株组的评估、杀真菌活性测定、使用皮肤相关细胞模型的体外安全性测试、验证的皮肤病学安全性测定以及扩展的稳定性研究，之后该制剂才可被视为临床或商业开发候选。
结论部分翻译：HES在所评估实验条件下抑制了M. pachydermatis和T. rubrum的可见生长，MIC值分别为125和750 μg mL
?1。含HES洗发剂产生的T. rubrum CFU计数显著低于洗发剂基质，而含HES与含酮康唑制剂之间未检测到统计学显著差异，该发现不应被解释为制剂间等效性的证据。此外，在30天初步稳定性研究期间未观察到所评估感官和理化参数的明显变化。这些发现支持进一步研究从A. sisalana残渣获得的HES作为抗真菌化合物的潜在来源。在该制剂可被视为临床或商业应用候选之前，需要进行化学表征、对额外真菌菌株的评估、杀真菌和安全性评估以及扩展的稳定性研究。
