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大多数陆生植物通过C3途径进行光合作用，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）将CO2固定为三碳酸。C4途径是一种生化CO2浓缩机制，在特化的叶片解剖结构背景下运行，将CO2浓缩于Rubisco周围，因此更为高效。将C4途径引入C3作物水稻
大多数陆生植物通过C3途径进行光合作用，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）将CO2固定为三碳酸。C4途径是一种生化CO2浓缩机制，在特化的叶片解剖结构背景下运行，将CO2浓缩于Rubisco周围，因此更为高效。将C4途径引入C3作物水稻可使产量提高50%。此前在转基因水稻中表达五种C4酶已导致通量通过第一步，但尚无证据表明循环后期步骤存在通量。本研究开发了新的转基因水稻株系和检测C4循环活性的方案：通过C3化合物的羧化将CO2固定为C4酸、脱羧、Rubisco对CO2的再固定以及C3供体的再生。研究证明这四个核心C4反应在水稻中运行，建立了向功能性CO2浓缩机制推进所需的体内通量框架。
光合作用是几乎所有碳进入生物圈的过程，包括农业中全部食物和饲料生产。迫切需要提高农业产量以跟上世界人口增长并在气候变化面前稳定产量。大多数陆生植物进行C3光合作用，CO2进入叶片后由Rubisco在卡尔文-本森循环（CBC）中同化为三碳代谢物3-磷酸甘油酸（3PGA）。Rubisco还催化与O2的竞争性反应，产生2-磷酸乙醇酸，这是一种抑制性代谢物，通过光呼吸过程回收。这种不忠实性消耗了光反应产生的多达50%的ATP和NADPH，并对气孔导度和氮分配施加限制。在蓝细菌、绿藻和陆生植物进化过程中，围绕Rubisco浓缩CO2并抑制与O2副反应的生化和形态适应反复出现。其中一种适应是C4光合作用，在过去3000万年中在60多个植物谱系中独立进化。C4植物首先在叶肉（M）细胞中利用对O2不敏感的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）将CO2固定为C4酸，C4酸扩散至相邻的维管束鞘（BS）细胞，在那里脱羧释放CO2供Rubisco再固定。这种CO2/碳浓缩机制（CCM）导致比C3植物更高的光合速率和更好的水分和氮利用效率。在水稻等进行C3光合作用的主粮作物中安装C4途径预计可使产量提高多达50%。
在C3植物如水稻中建立C4循环需要修改解剖和生化性状。具体而言，叶脉周围的BS细胞中的叶绿体需要功能化，叶脉间距需要减小以使BS与M细胞比率接近1（即叶脉间M细胞数需从约6-9个减少至仅2个），且各C4酶需在M或BS细胞中特异性高水平积累并有活性。多项将编码单个C4酶的基因工程导入C3植物的研究报道了可提取酶活性增强但无体内酶活性增强。在C4途径被发现时，14CO2脉冲-追踪标记实验提供了体内通量信息，显示脉冲期C4酸强标记，追踪期C4酸标记快速丢失并持续向3PGA移动。在此前将C4循环工程导入C3植物的尝试中，Lin等报道将玉米C4循环所需最低限度四种酶（ZmPEPC、ZmNADP-MDH、ZmNADP-ME和ZmPPDK）的编码基因导入水稻IR64，Ermakova等报道将此最低组合加碳酸酐酶（CA）导入水稻Kitaake。使用了合适启动子在正确细胞类型中驱动高水平转基因表达，两项研究中可提取酶活性均高于相应野生型对照。值得注意的是，可提取PEPC活性增加三倍导致13CO2脉冲实验中四碳化合物苹果酸和天冬氨酸标记增加十倍，表明C4循环的羧化步骤在转基因株系中发挥功能。然而，13CO2脉冲-追踪实验未能发现脱羧增强的证据，尽管可提取NADP-ME活性增加七倍，且未找到直接测量PPDK通量的方法。因此，虽然引入最低组合C4循环酶导致PEP羧化增强，但无证据表明C4循环后期步骤通量增强。
本研究报道了所有五种C4途径酶适当表达的新转基因水稻株系，包括NADP-ME表达为BS细胞特异性且可提取活性超过C4植物中一半的株系。研究还报道了足够灵敏的新方案，可检测C4循环四个核心步骤通量的微小增量。转基因水稻株系表征揭示了通过C4循环每一步的通量，这是追求C4水稻的里程碑式成就。
在研究背景方面，全球粮食安全面临人口增长和气候变化的双重压力，提高作物光合效率是增加产量的关键途径。C4植物因其CO2浓缩机制而具有更高的光合效率和资源利用效率，将C4途径工程导入水稻是国际C4水稻联盟的重大目标。然而，此前的研究虽然成功表达了C4酶并检测到PEPC介导的羧化增强，但未能在体内证明脱羧、CO2再固定和PEP再生等下游步骤的功能，这主要受限于检测方法对C3光合背景低水平通量的灵敏度不足以及C3叶片解剖结构的限制。因此，本研究旨在开发灵敏的通量检测方案并在改良的转基因株系中验证C4循环四步核心反应的体内运行。
研究人员开展了以下工作：首先通过dTALE-STAP系统提高ZmNADP-ME在BS细胞中的表达，并与已有M细胞表达CA、PEPC、NADP-MDH和PPDK的株系杂交，获得所有五种C4酶高水平积累的F2代株系；其次开发了基于13CO2脉冲-追踪标记、[4-13C]苹果酸/[4-13C]天冬氨酸饲喂和[2,3-13C2]丙酮酸饲喂的检测方案，结合同位素异构体分析和数学校正，实现了对PEPC羧化、NADP-ME脱羧、Rubisco再固定和PPDK通量的定量检测。研究得出结论：四种核心C4反应在转基因水稻中运行，建立了向功能性CCM推进所需的体内通量框架。这一成果的重要意义在于首次在C3作物中证实了C4生化途径的完整体内通量框架，为C4水稻工程提供了关键的检测工具和概念验证，论文发表在《Nature Plants》。
在关键技术方法方面，研究主要使用了以下手段：（1）利用dTALE-STAP合成转录因子系统驱动ZmNADP-ME在BS细胞中高水平表达，并通过杂交获得五酶共表达株系；（2）13CO2脉冲-追踪标记实验结合LC-MS/MS同位素异构体分析，通过 summed isotopologue abundance 估算PEPC羧化通量，通过校正后m1苹果酸/天冬氨酸衰减速率估算脱羧通量；（3）[4-13C]苹果酸和[4-13C]天冬氨酸通过蒸腾流饲喂离体叶片，在环境CO2和低CO2（50 ppm）条件下检测3PGA富集以评估脱羧和Rubisco再固定；（4）[2,3-13C2]丙酮酸饲喂检测m2 PEP形成以评估PPDK通量；（5）免疫印迹和免疫定位验证C4蛋白的积累和细胞特异性定位。样本来源为水稻粳稻品种Kitaake的野生型和转基因株系。
研究结果方面，首先在"Generation of transgenic rice lines accumulating high levels of all five core C4 enzymes"部分，研究人员通过dTALE-STAP系统获得了NADP-ME蛋白积累达玉米水平约一半的株系，其中MEBS×29株系NADP-ME特异性定位于BS细胞，MEBS&M×B6株系则定位于BS和M细胞。F2代株系中NADP-ME蛋白积累超过玉米的25%，体外活性分别为C4植物Setaria viridis和Sorghum bicolor的12-16%和30-38%。CA、PEPC、NADP-MDH和PPDK蛋白水平为玉米的20%至>100%，优先积累于M细胞。体外可提取活性方面，PEPC、NADP-ME和PPDK分别约为玉米的3.4%、12-38%和15%。
在"Up to tenfold enhancement of CO2 fixation into C4 acids in transgenic rice lines"部分，研究人员通过13CO2脉冲实验，采用 summed labelled isotopologues 方法排除CBC来源的标记干扰，发现所有转基因株系苹果酸和天冬氨酸标记同位素异构体总和上升更快。线性回归估算PEPC通量为2.2-7.4 nmol g?1 FW s?1，较野生型增强4-10倍。
在"Decarboxylation of C4 acids is detected by pulse–chase in transgenic rice lines"部分，研究人员通过校正追踪期由m1 PEP继续合成m1苹果酸和天冬氨酸的贡献，检测到所有转基因株系（除线29外）校正后m1苹果酸/天冬氨酸的显著负斜率，证明脱羧发生。MEBS×29株系（BS细胞高NADP-ME）显示出比亲本线29更陡的显著负斜率，脱羧通量估计为0.21-2.3 nmol 13C g?1 FW s?1。
在"C4-acid decarboxylation, 13C refixation by Rubisco and flux at PPDK are detected in transgenic rice lines by malate, aspartate and pyruvate feeding"部分，研究人员通过[4-13C]苹果酸和[4-13C]天冬氨酸饲喂实验，发现转基因株系中3PGA富集比野生型上升更快，且在50 ppm CO2下富集更快，证明脱羧释放的13CO2被Rubisco再固定。柠檬酸标记可忽略，排除了三羧酸循环代谢途径。通过[2,3-13C2]丙酮酸饲喂，转基因株系中m2 PEP丰度高于野生型，证明PPDK通量增强。NADP-ME通量估计为1.8-7.3 nmol g?1 FW s?1，PPDK通量为1.2-3.7 nmol g?1 FW s?1。
在"Quantitative estimation of fluxes"部分，研究人员估算了各步骤体内通量占引入酶能力的比例：PEPC为4.1-13.6%，NADP-ME为1.8-64%（高ME株系中<5%），PPDK为4.4-14%。所有通量估计值均远低于C4植物所需水平（PEPC、NADP-ME和PPDK分别约为C4植物所需的2-7%、4-10%和1-3%）。
讨论部分总结：研究人员指出测量体内通量是任何代谢途径工程的前提。本研究证明玉米C4酶基因在水稻中的表达导致C4循环所有四个核心步骤的显著通量增强，但估计的体内通量通常仅为引入酶能力的一小部分，且可能为最低估计值。此前将C4酶工程导入水稻的尝试成功引入了蛋白质但对可检测的体内通量影响很小或无影响，部分原因是引入活性低，但主要复杂因素是在快速C3光合背景下检测低水平通量的困难以及引入酶运行的解剖背景。水稻叶脉间有6-9个M细胞而玉米和高粱通常有2个，导致单位叶面积或鲜重BS细胞较少，BS特异性积累的酶在全叶基础上的活性显得较低。考虑上述因素使研究人员能够开发出足够灵敏的方法在C3解剖和光合背景下检测C4通量。这些方法可直接检测C4循环四个关键步骤的体内通量。虽然未明确测试，脉冲期苹果酸和天冬氨酸的快速标记以及饲喂实验中苹果酸和天冬氨酸的相互转化提供了ZmNADP-MDH体内活性的间接证据。研究人员还开发了基于底物和产物标记动力学的绝对通量估算方法。这些方案具有局限性，代谢物区室化尤其是苹果酸是主要复杂因素，但不严重影响PEPC（胞质）通量估算，而影响叶绿体NADP-ME脱羧和PPDK的估算。尽管存在不确定性，脉冲-追踪实验和[4-13C]苹果酸饲喂两种完全独立的方法提供了相似的脱羧速率估计。饲喂方法中标记苹果酸/天冬氨酸向BS细胞的供应速率可能限制脱羧速率，尤其在水稻中木质部薄壁组织共质体与韧皮部和周围维管连接较差。体内通量低于有效CCM所需水平。与C4植物相比，转基因水稻中m1苹果酸和天冬氨酸仅占池的约10%（C4植物>50%），羧化和脱羧速率分别为4-6和1-2 nmol 13C g?1 FW s?1（C4植物为103-179和65-150 nmol 13C g?1 FW s?1）。进一步提高水稻通量需要更高表达PPDK尤其是PEPC，并更好地利用引入酶能力。多种因素限制玉米PEPC在水稻中的体内活性，包括已知的磷酸化机制。NADP-MDH的体内活性可能受硫氧还蛋白介导还原不足的限制，PPDK受磷酸化/去磷酸化不足的限制。体内通量还可能受内源代谢物转运蛋白活性低的限制。C4循环功能在水稻中的能力将固有地受C3叶片解剖限制，水稻与C4植物的解剖差异也导致转基因株系体内通量被低估。高粱每线性毫米成熟叶片平均有10条叶脉而水稻仅5.5条，校正因子为1.8。PEPC和PPDK的数值校正因子不太重要，但叶脉间距施加的扩散限制仍可能相关。C4植物中M和BS细胞间胞间连丝连接大大增强以最大化扩散过程，而水稻中M细胞间胞间连丝密度低一个数量级。因此，脉冲-追踪实验中检测到的大部分C4通量可能发生在邻近BS的M细胞中。水稻C4酶体内通量能力的真实图景只有将酶引入修饰的解剖底盘后才能获得。研究结论翻译：研究人员已证明表达玉米C4酶基因在水稻中导致C4循环所有四个核心步骤的显著通量增强，与引入酶的活性一致。估计的体内通量通常仅为引入酶能力的一小部分，但估计的体内通量是近似的且可能为最低估计值。这些结果证明四种核心C4反应在转基因水稻中运行，建立了向功能性CO2浓缩机制推进所需的体内通量框架。
