《Sensors and Actuators Reports》：Polyaniline-based fluorescence nucleic acid biosensor for SARS-COV-2 RNA monitoring: from analytical validation to wastewater analysis
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本研究成功开发了一种基于聚苯胺（PANI）的荧光DNA生物传感器，用于检测SARS-CoV-2 RNA。研究人员系统研究了PANI合成参数（尤其是合成时间）及紫外（UV）照射对传感器性能的影响。随后对探针浓度优化、对靶标与非靶标序列的选择性以及灵敏度进行了评估
本研究成功开发了一种基于聚苯胺（PANI）的荧光DNA生物传感器，用于检测SARS-CoV-2 RNA。研究人员系统研究了PANI合成参数（尤其是合成时间）及紫外（UV）照射对传感器性能的影响。随后对探针浓度优化、对靶标与非靶标序列的选择性以及灵敏度进行了评估。采用浓度依赖性荧光测量建立校准曲线。最后，利用实际废水样品和加标后实验评估所开发传感器的检测能力及复杂环境条件下的基质效应。结果表明，UV照射（1200 μJ·cm?2，2 min）显著增强了PANI–DNA界面的荧光响应和传感性能；生物传感器在超低浓度下对互补SARS-CoV-2 RNA表现出高选择性；杂交诱导的荧光猝灭实现了灵敏的无标记检测，检出限（LOD）低至1.83 × 10?? mM；所开发平台在废水样品SARS-CoV-2监测中展现出可靠的适用性，荧光猝灭信号与逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）循环阈值（Ct）之间呈强相关性（R2 = 0.9025）。
研究背景：COVID-19大流行凸显了在人群层面监测病毒传播的迫切需求。基于废水的流行病学（WBE）作为一种有力且互补的方法，可通过检测废水中蓄积的病毒RNA来追踪SARS-CoV-2的流行趋势，具有成本效益高、非侵入性和早期预警等优势。目前废水中SARS-CoV-2检测主要依赖逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），尽管其灵敏度和特异性高，但存在成本高、分析时间长、需要专业实验室基础设施等局限，限制了其用于快速和大规模环境监测。荧光生物传感器因灵敏度高、响应快、操作简单而受到关注。导电聚合物尤其是聚苯胺（PANI）因其独特的物理化学性质（离域π电子体系、多种氧化态、可质子化胺/亚胺官能团）而备受关注。然而，基于PANI的荧光传感器在废水等复杂环境基质中检测病毒RNA的应用仍然有限，且影响传感器性能的关键参数（如UV照射条件、探针浓度、靶标特异性、聚合物制备条件）尚未被系统研究。因此，本研究旨在开发一种基于PANI的荧光生物传感器用于废水中SARS-CoV-2 RNA检测，整合材料优化与分析验证。
研究人员开展了以下研究：首先考察PANI合成参数（特别是合成时间）和UV照射对传感器性能的影响；随后评估探针浓度优化、对靶标和非靶标序列的选择性以及灵敏度；采用浓度依赖性荧光测量建立校准曲线；最后利用实际废水样品和加标后实验评估传感器的检测能力和复杂环境条件下的基质效应。研究得出以下结论：探针浓度和UV照射条件关键影响传感器性能，适度UV暴露（1200 μJ·cm?2，2 min）和最优探针负载（1 mM）提供最高的荧光增强和传感稳定性；生物传感器对互补SARS-CoV-2 RNA表现出强选择性，非互补β-珠蛋白序列产生可忽略的荧光变化；互补的电化学阻抗谱（EIS）、循环伏安法（CV）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析提供了杂交相关界面修饰的 convergent 证据；平台在10?1?–10?? mM范围内表现出浓度依赖性荧光响应，对数校准拟合良好（R2 = 0.9934）；基于空白的LOD和LOQ分别统计估计为1.83 × 10??和6.11 × 10?? mM；21天稳定性评估表明荧光响应在储存期间得以保持；生物传感器成功应用于城市废水和血液透析废液的纯化RNA提取物，加标实验揭示相对荧光响应幅度分别为92.3%和15.1%，与RT-qPCR测量呈强相关性（R2 = 0.9025）。重要意义在于：这些发现凸显了基于PANI的荧光传感平台用于无标记核酸识别和环境监测的潜力，为开发自动化和分散式病毒RNA监测平台提供了有前景的基础。
关键技术方法：研究人员采用化学氧化聚合法合成PANI（以过硫酸铵为氧化剂，在氯仿/水体系中加入十二烷基苯磺酸钠，0–5°C反应24 h后升至室温再反应24 h）；通过UV交联（1200 μJ·cm?2，2 min）将DNA探针固定于PANI表面；利用荧光分光光度法（激发450 nm，发射410–480 nm，监测452 nm）进行检测；采用EIS、CV和ATR-FTIR对传感界面进行互补表征；使用一步法RT-qPCR（Solis Green One-Step kit）和Qubit荧光定量作为参比方法。废水样品来源：2026年3月12日采集自Sfax North污水处理厂的24 h混合废水样，以及Hédi Chaker大学医院血液透析单元的废透析液。
研究结果：
3.1 UV和探针浓度对PANI荧光性能的影响：通过独立改变探针DNA浓度和UV照射参数，发现所有荧光光谱在450–455 nm处保持特征发射峰，无显著光谱位移；在固定UV条件下，荧光强度随探针DNA浓度从0.001至1 mM逐渐增加，但在10 mM时明显下降，确定最佳探针浓度为1 mM；适度UV暴露（1200 μJ·cm?2，2 min）产生显著荧光增强，而增加UV剂量和时间（2400 μJ·cm?2，4 min）则降低荧光强度。
3.2 荧光猝灭和浓度依赖性响应：在SARS-CoV-2靶RNA浓度10?1?至10?? mM范围内，荧光强度随靶浓度增加逐渐降低，发射峰稳定在452 nm，表明传感机制主要依赖荧光强度调制；对数回归方程为log F = 5.616 + 0.01777 log C，R2 = 0.9934，p = 0.000228；基于空白测量的LOD和LOQ分别估计为1.83 × 10??和6.11 × 10?? mM。
3.3 选择性荧光检测：在10?1? mM浓度下，互补SARS-CoV-2 RNA产生显著荧光猝灭，非互补β-珠蛋白靶标荧光谱基本不变；Student's t检验（p = 0.0385）证实两种响应差异显著，表明荧光响应源于特异性杂交而非非特异性吸附。
3.4 电化学和ATR-FTIR表征：EIS显示电荷转移电阻从原始PANI的168 Ω增至PANI-SARS-CoV-2 Probe+Target的2810 Ω（约16.7倍增加）；CV显示氧化还原峰电流按PANI > PANI-SARS-CoV-2 Probe > PANI-SARS-CoV-2 Probe+Target顺序递减；ATR-FTIR显示1140 cm?1和1580 cm?1附近谱带变化，与掺杂PANI电子结构和醌环振动相关，表明杂交相关界面修饰。
3.5 分析性能和统计验证：所有测量CV值低于10%；单因素方差分析和Tukey事后检验显示组间差异显著（p < 0.05）；主成分分析（PCA）中PC1和PC2分别解释62.6%和25.1%的方差（累积87.7%），可清晰区分不同功能化阶段和靶标响应；21天稳定性监测显示信号保留率为101.78%，RSD为1.80%。
3.6 废水中SARS-CoV-2 RNA检测应用：在加标空白水、加标城市废水和废透析液中均观察到RNA杂交诱导的荧光猝灭；加标空白水荧光增强（+21,308 a.u.），而城市废水和废透析液分别显示荧光降低（?19,675 a.u.和?3,208 a.u.），表明基质依赖性响应方向反转；相对荧光响应幅度城市废水为92.3%、废透析液为15.1%；与RT-qPCR Ct值比较显示强相关性（R2 = 0.9025），Qubit定量数据一致。
讨论部分总结：本研究证明了PANI作为荧光转导平台用于选择性SARS-CoV-2 RNA识别的潜力。探针固定后的荧光增强表明PANI–DNA传感界面物理化学环境改变；电化学和光谱分析支持界面修饰参与传感行为。优化研究表明传感器性能取决于探针负载和UV诱导界面修饰之间的平衡，过量探针负载可能导致空间位阻、DNA分子间聚集和导电聚合物表面部分屏蔽。UV照射条件影响显著，1200 μJ·cm?2 2 min优于2400 μJ·cm?2 4 min。互补SARS-CoV-2 RNA引起荧光大幅下降，非互补β-珠蛋白对照响应微弱，支持序列依赖性光学识别。EIS显示电荷转移电阻增加，CV显示氧化还原峰电流降低，ATR-FTIR显示PANI局部化学环境变化，支持杂交相关界面重组。pH和离子强度可能通过调节PANI质子化、DNA探针固定时的静电相互作用和RNA杂交时的双链稳定性影响这些界面过程，是未来机理研究和传感优化的重要参数。浓度依赖性响应支持所提出的杂交依赖性传感行为，对数校准曲线与荧光核酸生物传感器的报道一致。低CV值（<10%）及ANOVA和Tukey分析支持传感响应的重复性和统计一致性。PCA和层次聚类揭示与探针功能化和靶RNA识别相关的独特荧光指纹，430–452 nm的光谱差异反映DNA固定后PANI荧光谱变化，456–470 nm的浓度依赖性变化提示RNA杂交相关的进一步修饰。城市废水（92.3%）和废透析液（15.1%）之间的对比表明在测试的1:10稀释条件下基质相关光学行为显著不同，废透析液中绝对响应降低可能与更强基质干扰一致，但相对于空白水的相反响应方向排除了将这些百分比单独解释为验证的RNA回收率或简单定量抑制因子的可能性，需要基质匹配校准和基于浓度的加标回收实验来明确评估分析准确性。21天稳定性实验支持PANI光学响应的耐久性，第21天信号保留101.78%，RSD为1.80%，略高于100%的值归因于正常实验变异性而非真实荧光增强。与代表性SARS-CoV-2传感平台比较，本PANI–DNA系统整合了PANI内源荧光、无需靶标扩增的直接序列特异性RNA识别以及在废水相关提取物中的实验评估，其浓度依赖性荧光响应在10?1?–10?? mM范围内研究，单独估计的LOD和LOQ按第3.2节解释，这些特征确立了补充性光学传感方法而非声称普遍优越的数值灵敏度。与常规快速检测框架的直接比较需谨慎考虑，因为广泛使用的方法主要靶向病毒结构蛋白（抗原检测）或宿主抗体（血清学检测），靶标分析物属于根本不同的生物类别（基因组核酸与蛋白质生物标志物或免疫球蛋白），其分析阈值反映不同传感机制而非直接等效的灵敏度水平。基于聚合物的材料和免扩增传感步骤为工作流程简化提供了空间，但当前样品制备仍包括RNA提取，且未进行标准化单次检测成本研究，因此未声称更低的总体检测成本或更优的基质耐受性。在稀释废水基质中生物传感器保持完全可操作，与RT-qPCR测量的强相关性（R2 = 0.9025）支持PANI传感方法用于废水分析的潜在适用性，为废水流行病学提供了有前景的工具。研究结论翻译：本研究成功开发了一种基于PANI的荧光生物传感器用于选择性SARS-CoV-2 RNA检测。结果表明探针浓度和UV照射关键影响传感器性能，适度UV暴露和最优探针负载提供最高的荧光增强和传感稳定性。生物传感器对互补SARS-CoV-2 RNA表现出强选择性，而非互补β-珠蛋白序列产生可忽略的荧光变化。互补的EIS、CV和ATR-FTIR分析提供了杂交相关界面修饰的 convergent 证据，支持其对观察到的荧光调制的潜在贡献。平台在所研究范围（10?1?–10?? mM）内表现出浓度依赖性荧光响应，对数校准拟合良好（R2 = 0.9934）。基于空白的LOD和LOQ统计估计分别为1.83 × 10??和6.11 × 10?? mM，提供了需要进一步实验验证的初步分析估计。统计和多变量分析进一步支持传感响应的重复性和特异性。21天稳定性评估提供了储存期间荧光响应保持的额外证据。重要的是，生物传感器成功使用城市废水和废血液透析液的纯化RNA提取物进行了评估。定量加标实验揭示相对荧光响应幅度分别为92.3%和15.1%，突出了光学响应的基质依赖性差异而非验证的分析回收率。此外，与RT-qPCR测量的比较证明了强关联（R2 = 0.9025），支持所提出平台用于废水流行病学的潜在适用性。总之，这些发现凸显了基于PANI的荧光传感平台用于无标记核酸识别和环境监测的潜力。未来工作应着重进一步阐明调控荧光调制的分子相互作用、提高分析灵敏度、评估传感器再生、可重复使用性和长期操作稳定性。额外研究还应解决残留基质干扰、基质匹配校准和实验验证的检测限，以增强复杂环境样品中的分析可靠性。一个主要前景是开发基于PANI的自动化平台用于污水处理厂SARS-CoV-2 RNA监测，整合自动采样、样品调理、基于PANI–DNA的荧光传感检测和实时数据采集。现场实施需要验证实际操作条件下的重现性、长期稳定性、抗生物污染性、基质效应和传感器再生。同时，应评估技术经济可行性，包括工业化和认证成本、CAPEX/OPEX、市场潜力以及与现有监测方法的竞争力，以支持从研究原型向实际监测解决方案的转化。
