《Sensors and Actuators Reports》：An integrated passive microfluidic–SERS platform for label-free plasma analysis from whole blood
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血浆广泛用于分子分析，但传统通过离心法分离血浆会增加设备与样本处理需求，从而限制分散化检测的应用。本研究提出了一种集成的被动微流控-表面增强拉曼光谱（SERS）平台，该平台在单一工作流程中整合了基于膜的血浆分离、无标记分子指纹图谱分析以及探索性机器学习分析。该
血浆广泛用于分子分析，但传统通过离心法分离血浆会增加设备与样本处理需求，从而限制分散化检测的应用。本研究提出了一种集成的被动微流控-表面增强拉曼光谱（SERS）平台，该平台在单一工作流程中整合了基于膜的血浆分离、无标记分子指纹图谱分析以及探索性机器学习分析。该器件在多层层叠聚二甲基硅氧烷（PDMS）结构中嵌入聚醚砜（PES）膜，无需离心或外部泵驱动即可直接从全血中分离血浆。该平台从100 μL全血中在约5 min内实现了98.9 ± 1.2%（均值 ± 标准误）的红细胞去除率和43.1 ± 2.7%（均值 ± 标准误）的血浆回收率。紫外-可见（UV–Vis）光谱和拉曼光谱表明，微流控分离血浆与传统离心血浆具有可比的光谱轮廓，拉曼测量显示出强相关性（r = 0.96）。Bland–Altman分析进一步表明两者具有良好一致性且偏差极小，支持主要血浆拉曼指纹得以保留。作为概念验证应用，研究人员利用SERS和探索性多变量分析对健康对照与光化性角化病（AK）患者的血浆样本进行了分析。主成分分析（PCA）、自组织映射结合学习矢量量化（SOM-LVQ）以及受试者工作特征（ROC）分析表明，被动血浆分离后疾病相关光谱结构得以保留，且微流控工作流程产生的探索性分类行为与传统制备血浆相当。ROC分析得出，芯片实验室（LoC）来源血浆的曲线下面积（AUC）为0.934（95%置信区间：0.915–0.950），传统离心血浆为0.935（95%置信区间：0.916–0.949）。鉴于每组仅8名独立供者的有限队列，上述结果作为可行性证据而非临床诊断验证呈现。该研究展示了一种实用的从样本到信号的工作流程，其中无离心血浆制备直接与无标记SERS传感相耦合。
研究背景方面，血液生物标志物在临床诊断中具有核心地位，可提供关于生理和病理过程的可及分子信息。血浆作为去除红细胞、白细胞和血小板后获得的无细胞组分，含有蛋白质、无细胞DNA、代谢物、激素和抗体等多种循环分子，是临床诊断和生化分析中最重要的生物流体之一。全血中细胞组分的存在会通过释放胞内分子、产生背景信号或物理阻塞分析系统等方式干扰分析测量，因此血浆分离是许多诊断工作流程中的关键样本制备步骤。临床实验室通常通过离心法获取血浆，但离心需要专用设备、 trained人员及数分钟处理时间，限制了其在分散化诊断和即时检验中的适用性。微流控技术为微型化血液处理和集成诊断系统提供了有希望的途径，已有多种微流控血浆分离策略被探索，包括基于过滤、流体动力学分离和惯性微流控方法等，但血浆制备与下游分子传感的直接集成仍较少被探索。表面增强拉曼光谱（SERS）因其能够生成分析物的化学特异性光谱指纹而成为强大的分子检测技术，然而可靠的SERS分析需要具有高均匀性和可重复性的纳米结构基底。本研究旨在解决上述需求，提出了一种概念验证性微流控器件，将有效的血浆分离与基于SERS的检测装置直接耦合，并选择光化性角化病（AK）作为概念验证生物学应用，以评估微流控血浆制备后疾病相关光谱差异是否仍可检测。该研究的新颖性不在于膜基血浆分离、商用SERS基底或多变量分析的单独使用，而在于将它们集成到一个被动式从样本到信号的工作流程中，用于全血的直接处理。
研究人员开展了集成被动微流控-SERS平台的研究，得出以下结论：该平台能够在约5 min内从100 μL全血中实现98.9 ± 1.2%的红细胞去除率和43.1 ± 2.7%的血浆回收率，无需离心或外部泵驱动；UV–Vis光谱、拉曼光谱和Bland–Altman分析表明微流控分离血浆与传统离心血浆之间具有强分析一致性（r = 0.96）；AK实验提供了概念验证性演示，表明微流控处理后疾病相关光谱结构仍可及，LoC来源与离心血浆之间具有可比的探索性分类行为。研究的重要意义在于演示并验证了一种集成的无离心从样本到信号工作流程，其中被动血浆分离直接与无标记SERS传感耦合，为分散化环境中的无离心分子传感提供了基础。
关键技术方法方面，研究人员采用熔融沉积建模（FDM）3D打印制备耐高温模具，以5:1（w/w）比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS） base与固化剂浇铸成型，通过氧等离子体处理实现不可逆键合，并在顶层与底层PDMS之间嵌入孔径450 nm的聚醚砜（PES）膜进行血浆分离。SERS测量使用商用金SERS基底（Gold SERStrate?，Silmeco），以苯硫酚作为探针分子评估增强因子。拉曼光谱采集使用Renishaw inVia Qontor共聚焦拉曼显微镜，785 nm激发激光，50×物镜，激光功率3 mW，光谱采集范围800–1800 cm?1。样本队列来源于DermaTech 2研究（伦理编号：25/YH/0028），健康对照（n = 8）和AK患者（n = 8）每组8名独立供者，血样在采集后2 h内处理，采用两步离心方案（2000 × g，15 min，重复两次）作为参考标准。数据分析使用MetaboAnalyst 6.0进行统计分析和多变量分析，SOM-LVQ通过SKiNET框架实现。
研究结果方面，3.1 微流控制造与器件完整性：通过复制PDMS结构的光学显微镜确认器件以高尺寸保真度制造，通道峰间变异约6.8%，毛细管宽度偏差8.3%，高度偏差?0.8%；PES膜在PDMS层间集成均匀，所有器件（n = 6）在45分钟运行中无泄漏，确认集成器件架构在操作期间保持了结构完整性和被动流动。3.2 血浆分离性能：集成微流控平台在被动毛细驱动流条件下实现快速血浆分离，红细胞去除效率达98.9% ± 1.2%，分离在约5 min内完成，从100 μL全血中回收平均血浆体积23.7 ± 1.5 μL，对应血浆回收率43.1 ± 2.7%（假设生理血细胞比容45%）；UV–Vis 414 nm吸光度测量显示LoC分离血浆（0.0043 ± 0.0010）略高于离心血浆（0.0033 ± 0.0012），两者血红蛋白污染均较低；六个器件间红细胞去除效率的变异系数（CV）为1.3%。3.3 SERS基底表征：扫描电子显微镜（SEM）成像显示商用金SERS基底上纳米结构特征密集且相对均匀分布，平均特征尺寸约116 ± 15 nm（n = 84）；以苯硫酚1 pM（SERS）和1 mM（常规拉曼）评估增强因子，三个特征谱带计算的平均EF为1.77×10?；四个不同位置的测量显示可比的特征拉曼特征，表明基底响应在测量条件下具有可重复性。3.4 血浆集成LoC–SERS分析：LoC分离血浆与离心血浆的拉曼光谱高度相似，特征谱带出现在约1000、1150–1200、1450和1650 cm?1，分别归因于苯丙氨酸、C–C/C–N伸缩模式、脂质和蛋白质中CH?/CH?形变以及蛋白质酰胺I振动；关键拉曼谱带的0–1最小–最大归一化强度在两种制备方法间显示强一致性；Bland–Altman分析显示平均偏差为0.0008 a.u.，95%一致性界限为?0.0080至0.0096 a.u.，支持两种血浆光谱的总体一致性。3.5 光化性角化病的探索性SERS分层：正常化光谱显示健康与AK组之间存在若干差异，主要光谱差异出现在约1003和1030 cm?1（苯丙氨酸和芳香分子振动相关区域），另在1130 cm?1、1208–1265 cm?1、约1445 cm?1和1605 cm?1附近观察到变化；SOM-LVQ分析显示两种血浆制备方法均观察到健康与AK样本的分离；PCA分析中LoC来源血浆PC1和PC2分别占总方差5.5%和2.6%（合计8.1%），离心血浆分别为5.3%和2.7%（合计8.0%），两组数据均显示健康与AK样本间部分分离但存在重叠；四种蛋白质靶标（p53、Ki-67、MMP-7、IL-8）的SERS光谱与AK血浆光谱之间观察到重叠拉曼特征，支持微流控血浆分离后这些光谱特征的保留；ROC分析中LoC来源血浆数据集最具信息量的特征AUC为0.934（95% CI：0.915–0.950），离心血浆为0.935（95% CI：0.916–0.949），在选定分类阈值下LoC来源血浆数据集灵敏度为91.0%、特异性为95.5%，离心血浆分别为92.4%和90.7%。3.6 器件可重复性与实用工作流程：独立制造的器件（n = 8）在血浆分离性能和稳定毛细驱动流方面表现一致，器件间分离效率或流动行为无显著变异；通过消除离心，平台减少了设备需求和样本处理复杂性，同时保持可重复的无标记分子分析；SWOT分析总结了平台的主要优势（无离心或外部泵的被动血浆分离、与SERS传感的直接集成、快速处理）、关键局限（小临床队列、不完全血浆回收、残留血细胞和潜在血浆组分损失的进一步评估需求）、机会（分离性能优化、更大独立队列验证、向分散化检测的进一步集成）和挑战（供者变异性、探索性分类分析的泛化性、进一步分析和临床验证需求）。
讨论部分总结：本研究开发了一种集成微流控-SERS平台，用于快速、无标记的血浆分析，无需离心。多层PDMS器件结合PES膜能够在约5 min内从全血中提取血浆，无需离心或外部泵。研究的主要贡献是演示并验证了一种集成的无离心从样本到信号工作流程，其中被动血浆分离直接与无标记SERS传感耦合。研究局限性包括每组仅8名独立供者的小临床队列限制了分类分析的统计功效和泛化性，每名供者获取的多个拉曼光谱为技术测量而非独立生物学样本；未来研究应纳入更大的独立队列、供者级外部验证和适当的训练/测试分离，进一步优化血浆回收率并集成光学读出可提高平台对分散化传感应用的适用性。研究结论翻译：本研究开发了一种用于快速、无标记血浆分析的集成微流控-SERS平台，无需离心。嵌入PES膜的多层PDMS器件能够在约5 min内从全血中提取血浆，无需离心或外部泵。实现了98.9 ± 1.2%（均值 ± 标准误）的红细胞去除率和43.1 ± 2.7%（均值 ± 标准误）的血浆回收率，同时UV–Vis光谱、拉曼光谱和Bland–Altman分析表明微流控分离血浆与传统离心血浆样本之间具有强分析一致性（r = 0.96）。被动血浆制备与SERS的集成使得无需中间离心步骤即可对血浆进行分子表征。AK实验提供了概念验证性演示，表明微流控处理后疾病相关光谱结构仍可及，LoC来源与离心血浆之间具有可比的探索性分类行为。重要的是，由于独立供者数量有限，本研究未确立临床诊断性能。因此，主要贡献是演示并验证了一种集成的无离心从样本到信号工作流程，其中被动血浆分离直接与无标记SERS传感耦合。
