《Talanta Open》：Rapid DBDI-MS screening of total lovastatin equivalents in dietary supplements after alkaline conversion: analytical performance and limitations
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本研究评估了介质阻挡放电电离质谱（DBDI-MS）作为膳食补充剂中莫纳可林K/洛伐他汀快速筛查方法的适用性。洛伐他汀及其羟基酸形式在电离过程中发生源内转化，产生无法区分的离子信号，限制了直接定量。研究人员采用碱性转化将洛伐他汀定量转化为羟基酸形式，以总洛伐他汀
本研究评估了介质阻挡放电电离质谱（DBDI-MS）作为膳食补充剂中莫纳可林K/洛伐他汀快速筛查方法的适用性。洛伐他汀及其羟基酸形式在电离过程中发生源内转化，产生无法区分的离子信号，限制了直接定量。研究人员采用碱性转化将洛伐他汀定量转化为羟基酸形式，以总洛伐他汀当量进行测定，并利用同位素标记内标补偿基质引起的信号变化。该方法在2.5–40 μmol/L范围内建立校准曲线（R2 = 0.975），检出限（LOD）为6.5 μmol/L，对应约1.3 mg/g的洛伐他汀总当量。六种空白膳食补充剂基质的基质效应为84.5%–100.8%，变异为6.4% RSD。该方法未能达到定量LC-MS方法的校准性能要求，因此被定位为半定量阈值筛查方法。对11种市售膳食补充剂的分析表明，DBDI-MS能正确区分洛伐他汀可检出样品与低于检出限的样品，仪器分析时间约为每个样品1.5 min。该工作流程适用于在现行法规框架下快速筛查需要进行确认性液相色谱（LC）分析的样品。
**研究背景与问题**
心血管疾病仍是全球主要死亡原因，高胆固醇血症是其重要关联因素，他汀类药物为一线药物治疗。洛伐他汀是首个进入临床实践的他汀类药物，虽已大部分被新型化合物替代，但其作为红曲（RYR）中的天然活性成分——莫纳可林K的内酯形式——仍具有重要现实意义。红曲膳食补充剂因消费者对天然替代疗法的兴趣而广泛商业化，产品形式包括单一成分及与其他生物活性成分的复配产品。莫纳可林K的乳酮形式与洛伐他汀化学结构完全相同，这一化学同一性导致其监管地位复杂化：在美国，洛伐他汀作为药品已获事先批准，含药理学相关量莫纳可林K的红曲产品不得作为膳食补充剂合法销售；欧盟则采取渐进式风险管理策略，2022/860号委员会法规将红曲中莫纳可林日摄入量限制在3 mg以下，并要求标签安全警示。2025年欧洲食品安全局（EFSA）再评估后结论认为无法建立红曲莫纳可林的安全摄入水平，2026年欧盟委员会提议在过渡期后禁止膳食补充剂中的红曲莫纳可林。与药品不同，红曲膳食补充剂中活性成分含量变异极大，独立市场调查持续报告合规性差的问题：美国28种市售红曲补充剂日摄入莫纳可林K变异超过120倍（0.09–10.94 mg），欧盟35种产品分析发现多种超标、标签不合规、可能掺假及细菌污染。这些发现凸显了验证法规合规性的可靠分析方法的必要性。
红曲中含多种结构相关莫纳可林，莫纳可林K（洛伐他汀）通常为主要成分，被认为是红曲补充剂降脂活性及不良反应的主要贡献者。该化合物以两种易互变分子形式存在：无药理活性的内酯型和有生物活性的羟基酸型，其互变强烈依赖pH和溶剂组成，因此分析过程中必须严格控制样品pH（通常4–5）和处理条件以最小化互变。质谱检测中还存在额外挑战：洛伐他汀羟基酸在电喷雾电离（ESI）过程中发生源内转化生成内酯，产生与天然洛伐他汀来源离子无法区分的信号。传统上采用色谱方法（HPLC-UV和LC-MS/MS）在定量前分离两种分子形式，虽稳健可靠但增加分析时间、限制样品通量。无需色谱分离的直接质谱方法可显著提高分析通量，但必须在无色谱分辨优势的条件下克服溶液相和源内互变问题。常压电离质谱可实现无需色谱分离的快速直接分析，其中介质阻挡放电电离（DBDI）兼具短分析时间和简便仪器配置，且已有商业化集成离子源。研究人员此前已证明其适用于膳食补充剂中违禁物质的快速筛查，但DBDI对经历广泛源内转化分析物的适用性尚未系统研究，洛伐他汀及其羟基酸在DBDI条件下的行为亦未探索。因此本研究评估DBDI-MS作为膳食补充剂中莫纳可林K/洛伐他汀快速筛查方法，重点关注无色谱分离条件下的电离行为、解决内酯-酸互变的分析策略开发以及识别需确认性色谱分析样品的实用工作流程。
**关键技术方法**
研究从捷克市场采购11种市售膳食补充剂（9种标注含红曲，其中7种声明莫纳可林含量；2种宣称降胆固醇但未明确标注含红曲）。每产品10粒胶囊或片剂合并匀质，约1 g匀质物经甲醇超声提取15 min作为起始材料。参考LC-UV定量采用simvastatin为内标，Chromolith? Performance RP-18e色谱柱分离，268 nm检测。DBDI-MS分析前，提取液经碱性转化（NaOH处理10 min后HCl中和）、加洛伐他汀-d9内标、稀释20倍后直接进样。DBDI源（SICRIT?）以1600 V、15 kHz运行，GC/SPME模块加热至300°C，氮气流速0.5–1.5 L/min，三重四极杆质谱仪以多反应监测（MRM）模式采集。方法评估涵盖校准性能、检出限、偏差、精密度和基质效应，基质效应采用六种经LC-UV确认不含洛伐他汀的空白膳食补充剂基质（两种红曲、两种平菇、一种植物甾醇、一种蔓越莓）在15 μmol/L水平评估。支持性LC-ESI-MS实验用于比较ESI与DBDI电离行为及验证碱性转化完全性。
**研究结果**
**DBDI与ESI电离行为比较**：洛伐他汀在ESI和DBDI正离子模式下均可检测，但离子种类差异显著。ESI中观察到丰富的[M+Na]?和[M+K]?加合物，而DBDI主要生成质子化洛伐他汀[M+H]?及铵加合物[M+NH?]?，碱金属加合物形成可忽略。洛伐他汀羟基酸在负ESI中优先检测，但纯标准品在正离子模式下也产生对应质子化洛伐他汀的[M-H?O+H]?离子信号，与既往报道的源内转化一致。DBDI主要产生正离子，对洛伐他汀酸不提供有效负离子响应；正DBDI模式下洛伐他汀酸形成[M+H]?和[M-H?O+H]?两种离子。研究表明，从ESI变为完全气相基的DBDI并未消除洛伐他汀羟基酸的源内转化，但机制可能不同：研究人员推测部分洛伐他汀羟基酸在通过活性等离子体区域时转化为内酯，随后两种分子形式独立电离，由于DBDI内能沉积较ESI更宽且位置依赖，部分质子化羟基酸离子统计上存留而未脱水，而接受较高内能的离子则失水形成[M-H?O+H]?，这些脱水离子与内酯直接生成的质子化离子无法区分，解释了m/z 405处的主导信号。
**定量策略评估：碱性与非碱性转化**：初始目标为在无色谱分离条件下同时定量洛伐他汀和洛伐他汀羟基酸。研究人员假设两种分子形式的氘代内标可补偿源内转化。评估了两种策略：第一种直接分析含两种形式样品，各分析物以对应氘代内标归一化；第二种分析前碱性转化，洛伐他汀定量转化为羟基酸，由羟基酸响应测定总洛伐他汀含量。两种策略用溶剂和六种空白膳食补充剂基质在两个浓度水平加标评估，各样品五次重复进样，以IS归一化峰面积的重复性（%RSD）为主要评价标准。直接定量策略对两种分析物产生显著不同结果：洛伐他汀-d9归一化虽减少部分分析变异，但IS归一化洛伐他汀响应仍高度变异，基质样品中达55% RSD，纯溶剂中亦约25% RSD，表明变异主要源于DBDI测量本身而非基质效应；相反，洛伐他汀羟基酸响应重复性显著更好。基于此，选择碱性转化作为首选定量策略：将所有洛伐他汀转化为羟基酸后分析，以分析上更可重复的羟基酸响应测定总洛伐他汀含量。因此该方法测定总洛伐他汀含量（以洛伐他汀当量表示）而非各分子形式单独浓度。碱性转化完全性经LC-MS/MS验证：200 ng/mL洛伐他汀溶液转化后洛伐他汀峰完全消失，信号仅出现在洛伐他汀羟基酸保留时间处，残留未转化洛伐他汀若存在则低于初始浓度的0.5%。含不同洛伐他汀/羟基酸初始比例（1:9至9:1）的混合物经碱性转化后IS归一化响应相当，平均响应变异仅约±6%。
**方法验证**：DBDI-MS方法就校准性能、筛查能力和基质效应评估。三次独立校准运行，2.5–40 μmol/L范围，加权（1/x）线性回归，R2为0.975，但反算浓度范围为标称值的75.3%–121.2%，未持续满足定量LC-MS方法性能预期，因此未作为完全定量方法 pursued，而以LOD（3.3×σ/S）作为半定量筛查的分析决策阈值。LOD为6.5 μmol/L，对应约3.3 μmol（1.3 mg）总洛伐他汀当量/g样品。六种不同空白基质加标QC样品中所有加标样品均正确分类为阳性，但一个QC样品准确度低于定量LC-MS常用的85–115%接受范围，支持DBDI-MS作为半定量筛查方法。基质效应在15 μmol/L评估，六种空白基质平均IS归一化响应与溶剂标准比较为84.5%–100.8%（轻度至中度离子抑制），六种基质间变异6.4% RSD，表明尽管无色谱分离，基质依赖信号变异可被同位素标记内标补偿。
**实际样品应用与LC-UV方法比较**：DBDI-MS方法应用于11种市售膳食补充剂，与参考LC-UV方法比较。四个样品（S1、S3、S4和S9）分类为低于LOD（<0.1至<0.2 mg/胶囊），其余七个样品DBDI-MS检测为阳性，参考LC-UV定量结果为1.4±0.0至3.1±0.1 mg/胶囊。DBDI-MS应视为快速筛查方法而非色谱定量的替代，能识别需确认性分析的样品。仪器分析时间约3 min（校准）和1.5 min/样品，显著短于常规LC方法。在现行法规（EU 2022/860，莫纳可林日摄入限3 mg）下，样品特异性LOD为0.3–1.3 mg/胶囊，低于所有研究产品的法规阈值（各含莫纳可林补充剂推荐日摄入量均为1粒胶囊），因此所提DBDI-MS工作流程适合作为选择需色谱定量样品的一线筛查方法。相反，所提红曲莫纳可林禁令未规定分析决策限或报告阈值，因此该方法在新立法下的适用性需待相应分析要求确定后方可评估。本方法主要局限源于洛伐他汀本身不寻常的行为：内酯与羟基酸形式间源内互变 necessitated DBDI-MS分析前的碱性转化步骤，虽证明可重复且易纳入标准化样品制备方案，但抵消了常压电离技术的简便性。该局限为洛伐他汀特有而非DBDI-MS本身固有；对于不发生类似源内转化的分析物，直接DBDI-MS分析可提供更简便工作流程，同时保留快速分析、仪器简便和高样品通量的优势。
**讨论与结论**
研究人员开发了无需色谱分离的DBDI-MS快速工作流程用于筛查膳食补充剂中总洛伐他汀含量。由于洛伐他汀和洛伐他汀羟基酸在直接电离过程中发生互变并产生重叠信号，可靠分析需在测量前将洛伐他汀碱性转化为羟基酸，该策略改善了重复性并实现以洛伐他汀当量评估总洛伐他汀。该方法未达到确定性定量分析所需的校准性能，应视为半定量、阈值型筛查程序而非经验证色谱定量的替代。在所研究的商业样品中，DBDI-MS正确区分了洛伐他汀可检出产品与低于分析检出限的产品，同时显著缩短仪器分析时间。当前工作流程适合快速识别应进行确认性LC分析的样品，尤其在现行法规框架下样品特异性检出限低于规定的3 mg日莫纳可林阈值。然而，其在所提莫纳可林禁令下的适用性将取决于最终立法采用的分析决策限和报告要求。在解决这些局限性后，DBDI-MS可提供实用的高通量一线筛查，减少需较慢确认性色谱分析的样品数量。
