《Toxicology Reports》：Comprehensive safety and toxicity evaluation of
Lactiplantibacillus plantarum LMT1-48, a potential probiotic strain isolated from Kimchi
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益生菌被广泛商业化，作为功能性食品和膳食补充剂的关键成分；然而，确保其安全性对消费者至关重要。特别是，安全性必须在菌株水平上进行仔细评估，因为不同菌株之间的功效和潜在风险均可能存在差异。本研究通过表型（phenotypic）、基因组（genomic）和毒性（t
益生菌被广泛商业化，作为功能性食品和膳食补充剂的关键成分；然而，确保其安全性对消费者至关重要。特别是，安全性必须在菌株水平上进行仔细评估，因为不同菌株之间的功效和潜在风险均可能存在差异。本研究通过表型（phenotypic）、基因组（genomic）和毒性（toxicity）研究，对一株新型益生菌菌株——植物乳植杆菌LMT1-48（Lactiplantibacillus plantarum LMT1-48）的安全性进行了全面评估。所有测试抗生素的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）均低于欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）指南的临界值。植物乳植杆菌LMT1-48未表现出溶血活性（hemolytic activity）或细胞毒性（cytotoxicity）。研究人员还对有害代谢产物的产生进行了评估。全基因组测序（whole genome sequencing）未揭示任何抗生素耐药性或毒力相关基因。单次和重复给药口服毒性研究均未在任何剂量水平下显示与处理相关的毒理学变化。总体而言，研究结果表明，植物乳植杆菌LMT1-48是一种可供人类安全食用的益生菌菌株。
一、研究背景与目的
益生菌被国际益生菌与益生元科学协会定义为“当给予足够剂量时，能够为宿主带来健康益处的活微生物”。乳酸菌和双歧杆菌是最常见的益生菌，部分肠球菌、酵母菌和芽孢杆菌属物种也属于益生菌范畴。随着对人体微生物组认知的扩展，一些分离自人类胃肠道的物种，如阿克曼氏菌、拟杆菌属和梭菌属，被归类为下一代益生菌。益生菌口服后主要通过抑制病原微生物、产生生物活性代谢物和增强肠道屏障发挥有益作用，某些菌株还具有从免疫调节到改善心理障碍等独特功效。然而，益生菌菌株在健康个体中通常不会造成危害，但在免疫功能低下的个体中，已有少数菌血症和感染导致严重疾病的病例报道。2023年，美国食品药品监督管理局就向早产儿施用益生菌的潜在风险发出警告。此外，特定益生菌菌株可能产生有害代谢产物，如次级胆汁盐、D-乳酸或生物胺，从而引发较轻的风险。部分益生菌携带的抗菌素耐药基因还可能通过水平转移传递给胃肠道中的共生菌或机会性病原体，造成临床威胁。
因此，开展安全性评估对于保障益生菌的安全消费十分必要。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织和欧洲食品安全局提出的监管指南在全球范围内被最广泛引用和应用。根据这些指南，益生菌的抗生素耐药性、溶血性、产毒性及致病性应在菌株水平进行评估，并应通过全基因组序列分析识别抗生素耐药基因或毒力因子等风险因素。植物乳植杆菌LMT1-48是从自制泡菜中新分离的菌株。体外和体内研究显示，该菌株可减少脂肪细胞分化、脂肪生成和体脂积累，双盲随机对照临床试验也证实其能显著降低体脂重量并改变肠道微生物组。尽管这些结果使植物乳植杆菌LMT1-48成为管理肥胖的优良功能性食品或膳食补充剂成分，但由于其属于新型菌株，其安全性仍需全面评估。本研究旨在根据EFSA和韩国食品药品安全部的指南，评估植物乳植杆菌LMT1-48供人类食用的安全性，并开展单次给药和13周重复给药口服毒性研究以更全面地评估其安全性。
二、研究内容与主要结论
研究人员从韩国Medytox公司分离得到植物乳植杆菌LMT1-48，依据EFSA指南和韩国MFDS指南，通过表型、基因组和毒性研究对其安全性进行了全面评估。抗生素敏感性试验显示，该菌株对七种测试抗生素的最低抑菌浓度均低于EFSA指南规定的临界值，表明其不具有抗生素耐药性风险。溶血活性评估显示该菌株在血琼脂平板上呈现γ-溶血（无溶血）表型，与植物乳植杆菌模式菌株一致。基于HT-29人结肠腺癌细胞系的乳酸脱氢酶释放试验表明，该菌株的细胞毒性显著低于致病菌大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌。有害代谢产物评估显示，该菌株具有胆汁盐水解酶活性，能够解离甘氨脱氧胆酸并产生D-乳酸和L-乳酸。全基因组测序结果确认该菌株属于植物乳植杆菌物种，基因组由一个环状染色体和四个质粒组成，ResFinder和VirulenceFinder分析均未检测到抗生素耐药基因或毒力因子。单次给药口服毒性研究显示，给予高达5000 mg/kg（1.0×1012 CFU/kg）剂量未产生任何毒理学效应。13周重复给药口服毒性研究中，给予高达5000 mg/kg/天（1.85×1012 CFU/kg/天）剂量也未观察到与处理相关的毒性变化。该研究的重要意义在于，通过多维度综合评估证实了植物乳植杆菌LMT1-48的安全性，为其作为抗肥胖功能性食品或膳食补充剂成分的商业化应用提供了关键的安全性数据支持。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法。抗生素敏感性通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度，依据EFSA指南判定。溶血活性通过血琼脂平板培养观察。细胞毒性采用HT-29细胞乳酸脱氢酶释放试验评估。有害代谢产物评估包括胆汁盐解离试验和D-乳酸/L-乳酸定量检测。全基因组测序采用PacBio RS II平台完成，基因组注释使用Prokka软件。生物信息学分析使用了FastANI、ResFinder、VirulenceFinder、PlasmidFinder、PHASTEST和MobileElementFinder等工具，并采用tBLASTn算法比对生物胺合成酶基因。动物实验方面，单次给药毒性研究依据OECD TG 420和425指南，13周重复给药毒性研究依据OECD TG 408指南，均使用Sprague-Dawley大鼠，由CorestemChemon Inc.按照良好实验室规范执行。
四、研究结果
3.1 抗生素敏感性：通过肉汤微量稀释法测定，植物乳植杆菌LMT1-48对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的MIC值分别为1、0.5、0.5、<0.0625、<0.0625、16和4 μg/ml，均低于EFSA指南的临界值，表明该菌株对抗生素敏感。
3.2 溶血特性：通过血琼脂平板培养，植物乳植杆菌LMT1-48未显示溶血现象（γ-溶血），与植物乳植杆菌模式菌株KCTC3108一致，而大肠杆菌KCTC2441显示α-溶血，兽疫链球菌KCCM40305显示β-溶血。
3.3 细胞毒性：通过HT-29细胞LDH释放试验，与致病菌大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌相比，植物乳植杆菌LMT1-48处理HT-29细胞释放的LDH显著降低，表明该菌株对人结肠细胞无细胞毒性。
3.4 胆汁盐解离活性：通过MRS琼脂平板培养，植物乳植杆菌LMT1-48在含甘氨脱氧胆酸的培养基上形成白色沉淀，表明具有胆汁盐水解酶活性；在含牛磺脱氧胆酸的培养基上未形成沉淀。
3.5 D-乳酸产生：通过乳酸检测试剂盒定量，植物乳植杆菌LMT1-48在MRS肉汤中培养后产生D-乳酸6.80±0.57 g/L和L-乳酸7.41±0.61 g/L。
3.6 基因组分析：全基因组测序获得3,282,039 bp核苷酸和3,147个编码DNA序列，包含一个3,167,967 bp的环状染色体和四个质粒。ANI分析确认该菌株属于植物乳植杆菌。ResFinder未检测到抗生素耐药基因，VirulenceFinder未检测到毒力因子。PHASTEST鉴定出5个前噬菌体序列，MobileElementFinder鉴定出24个插入序列。生物胺合成酶基因比对未发现任何匹配。
3.7 单次给药口服毒性研究：在14天观察期内，各剂量组均未观察到与处理相关的死亡或临床体征，体重增长正常，尸检未见异常病变，给予高达5000 mg/kg（1.0×1012 CFU/kg）未产生毒理学效应。
3.8 十三周重复给药口服毒性研究：在91天给药期间，各剂量组均未观察到与处理相关的死亡。临床体征、体重、食物和水消耗、眼科检查、尿液分析、血液学、血清生化、器官重量以及大体和组织病理学检查均未显示归因于植物乳植杆菌LMT1-48的毒理学变化。观察到的少量散发性发现缺乏剂量依赖性、发生率低且无相关组织病理学改变，被判定为自发性背景变化，不具有毒理学意义。
五、讨论与结论
讨论部分指出，植物乳植杆菌物种因其在发酵蔬菜中的长期使用历史而被普遍认为是安全的，并已获得EFSA的合格安全推定地位。然而，每种菌株的安全性仍需在菌株水平进行彻底评估。抗生素耐药性是益生菌安全性的重要关注点，植物乳植杆菌LMT1-48对所有测试抗生素的MIC均低于EFSA临界值，全基因组分析也未预测到抗生素耐药基因，表明其传播抗菌素耐药性的可能性极低。在毒力方面，该菌株未表现出可检测的溶血活性，对HT-29细胞的细胞毒性可忽略不计，基因组中也未发现毒力相关基因。虽然基因组中存在5个前噬菌体区域和24个插入序列，但由于缺乏抗生素耐药或毒力因子相关基因，这些可移动元件不构成显著安全风险。在有害代谢产物方面，该菌株产生未结合胆汁酸和D-乳酸，因此在韩国商业化时需按MFDS规定标注警示标签。基因组中未发现生物胺合成酶基因，但讨论指出仍需进一步的实验研究来确证不同培养条件下的生物胺表型产生情况。两项口服毒性研究均未观察到任何剂量水平下与处理相关的毒理学变化，表明该菌株在大鼠中耐受性良好，单次给药研究最高剂量为1.0×1012 CFU/kg，13周重复给药研究最高剂量为1.85×1012 CFU/kg/天。考虑到益生菌的典型每日剂量范围为1×10?至1×1011 CFU，该菌株在此范围内是安全的。
研究结论为：植物乳植杆菌LMT1-48符合EFSA指南和多种国家监管框架的安全要求，可被视为安全的益生菌菌株。凭借其在减少肥胖方面的治疗潜力，该菌株可作为食品或膳食补充剂的优良功能性成分，其功效和安全性均有证据支持。
