《Ultrasonics Sonochemistry》：Ultrasound-surfactant-assisted extraction of flavonoids from
Zanthoxylum bungeanum leaves: process optimization, metabolomic characterization, and bioactivity evaluation
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本研究采用超声-表面活性剂辅助提取（USAE）方法，通过响应面法（RSM）优化花椒叶黄酮（FZBL）的提取条件。在超声功率300 W、频率20 kHz固定的条件下，当超声温度50°C、十二烷基硫酸钠（SDS）添加量2.9%（w/v）、超声时间50 min、乙醇
本研究采用超声-表面活性剂辅助提取（USAE）方法，通过响应面法（RSM）优化花椒叶黄酮（FZBL）的提取条件。在超声功率300 W、频率20 kHz固定的条件下，当超声温度50°C、十二烷基硫酸钠（SDS）添加量2.9%（w/v）、超声时间50 min、乙醇浓度61%（v/v）、液固比26 mL/g时，最大提取率达到21.05%。所得粗黄酮提取物经D-101大孔树脂进一步分级，分别用30%、50%和70%乙醇洗脱，得到FZBL-1、FZBL-2和FZBL-3三个组分。紫外-可见光谱（UV–vis）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征表明，三个组分均具有黄酮类化合物的典型结构特征。基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的综合代谢组学分析推定注释了444种代谢物，其中包含418种黄酮类化合物，凸显了提取物中丰富的黄酮组成。生物活性测试表明，FZBL-2在HuH-7癌细胞中表现出最强的综合抗氧化、抗脂质过氧化和酶抑制活性以及最强的抗增殖活性，而FZBL-3在SGC-7901和MDA-MB-231癌细胞中表现出最强的抗增殖活性。多变量相关性分析确定了CDD、cinchonain Id、kaempferol triglucoside和HKDG为与FZBL生物活性相关的关键代谢物。这些发现为理解FZBL功能特性背后的生物活性成分提供了有价值的见解，并支持对天然健康促进成分的进一步研究。
研究背景：花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）为芸香科重要的经济栽培物种，具有食用、药用和工业应用价值。花椒叶作为花椒种植的主要副产物，自古以来用作调味剂和芳香剂，也用于传统医学。现有研究表明花椒叶富含挥发油、香豆素、黄酮类和生物碱等多种生物活性植物化学物，具有抗氧化、抗炎、心脏保护和抗肿瘤等广泛生物活性。黄酮类化合物是花椒叶生物活性的主要贡献者之一，因此高效提取花椒叶黄酮（FZBL）是该副产物资源化利用的关键。超声辅助提取（UAE）通过声空化和机械效应增强传质和细胞破碎，可提高提取效率并减少加工时间、能耗和溶剂用量。然而黄酮类化合物水溶性差，限制了UAE在水相体系中的效果，而大量使用有机溶剂对环境有负面影响。添加表面活性剂可通过其两亲性分子结构显著降低表面张力、促进溶剂渗透并通过胶束形成增溶疏水性目标化合物，从而缓解上述局限。超声-表面活性剂辅助提取（USAE）的协同机制中，表面活性剂介导的增溶可促进空化诱导的细胞破碎和胞内成分释放，该策略已成功应用于番茄红素、多酚和黄酮类等多种植物源生物活性化合物，但尚未见USAE用于FZBL提取的报道。响应面法（RSM）作为实验设计、过程建模和多参数优化的统计工具已被广泛应用。因此本研究采用RSM优化FZBL的USAE提取工艺，对所得提取物进行纯化并通过UPLC-MS/MS进行代谢物谱分析，系统评价FZBL的抗氧化活性、酶抑制潜能和癌细胞抗增殖活性，以阐明其生物学功能并支持其作为增值功能成分的未来开发。本研究发表在《Ultrasonics Sonochemistry》。
关键技术方法：研究人员采用多功能恒温超声提取装置（300 W，20 kHz，Φ6 mm探头）进行USAE提取，通过单因素实验筛选超声温度、SDS添加量、超声时间、乙醇浓度和液固比，继而采用Box-Behnken设计结合RSM优化工艺参数。黄酮提取率采用NaNO?-Al(NO?)?-NaOH比色法于493 nm测定。纯化方面筛选五种大孔树脂，采用D101进行动态吸附-解吸优化并通过梯度乙醇洗脱制备不同极性组分。结构表征采用UV–vis和FTIR。代谢物谱分析采用UPLC-MS/MS结合MWDB数据库推定注释。生物活性评价包括DPPH•、ABTS?•、O??·、FRAP和脂质过氧化抑制等抗氧化实验，α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶抑制实验，以及针对SGC-7901、MDA-MB-231和HuH-7癌细胞的CCK-8抗增殖实验。统计分析采用SPSS 20和Origin 2025，代谢组学数据采用PCA、聚类分析和OPLS-DA。
研究结果：
3.1 单因素实验：超声温度50°C时提取率达最高18.8%，超过60°C后显著下降，可能归因于杂质共提取增强或黄酮结构热降解，故固定为50°C。SDS添加量3%时提取效率达峰值18.82%，进一步增加导致提取率下降，可能因过量胶束阻碍空化泡生成和声能传递。超声时间50 min时提取率达18.53%，提取过程可分为三个阶段，阶段1（0–30 min）超声与SDS协同加速溶剂渗透，阶段2（30–40 min）空化促进细胞壁破碎，阶段3（40–50 min）胶束形成达平衡，协同作用最大化。乙醇浓度60%时提取率达19.00%，黄酮类为两亲性分子，60%乙醇提供最佳极性平衡。液固比25 mL/g时提取率最高18.80%，过高液固比因超声能量限制导致细胞裂解不完全。
3.2 RSM分析与模型验证：以SDS添加量、超声时间、乙醇浓度和液固比为自变量建立Box-Behnken设计，模型极显著（P < 0.0001），R2 = 0.9820，R2adj = 0.9640，失拟项不显著。影响提取率的因素排序为液固比 > SDS添加量 > 乙醇浓度 > 超声时间。AB、AC、AD和BC交互作用显著，3D响应面和等高线图呈明显曲率和椭圆形。模型预测最优条件为SDS 2.87%、超声时间50.46 min、乙醇浓度60.84%、液固比25.83 mL/g，预测值20.74%。调整后实际条件为SDS 2.9%、50 min、61%乙醇、26 mL/g，实际提取率21.05%，与预测值偏差仅0.31%，表明模型准确可靠。
3.3 纯化与表征：AB-8和D101吸附效果显著优于其他树脂，D101解吸率89.39%、解吸量15.30 mg/g，为最佳树脂。动态吸附优化表明10 mg/mL上样浓度时吸附率达97.28%，pH 4–6范围内无显著变化，上样体积2 BV最佳。解吸最佳pH为6、乙醇浓度70%，流速2 BV/h、洗脱体积3.25 BV可实现完全解吸。梯度洗脱获得FZBL-1、FZBL-2和FZBL-3三个组分，亚甲蓝实验确认残留SDS低于检测限。UV–vis显示三个组分均具有黄酮特征性Band I（300–400 nm）和Band II（240–280 nm）吸收带，但峰位存在差异。FTIR显示FZBL-2具有更强更宽的O–H吸收带，FZBL-3在3000–2800 cm?1区域C–H伸缩振动最显著，各组分在1600–1650 cm?1区域芳环C=C骨架振动特征相似。
3.4 UPLC-MS/MS代谢组学分析：共推定注释444种化合物，包括418种黄酮类和26种鞣质。418种黄酮类分为9个亚类：黄酮醇182种、黄酮126种、二氢黄酮42种、二氢黄酮醇9种、异黄酮5种、查尔酮16种、花青素4种、黄烷醇25种和其他黄酮9种。黄酮醇和黄酮为主要成分。FZBL-1主要代谢物为黄烷醇、黄酮、二氢黄酮和其他黄酮（各超10%），FZBL-2和FZBL-3主要为黄烷醇、黄酮和二氢黄酮。PCA显示同组样本紧密聚类，三组分间明显分离。OPLS-DA模型R2X和R2Y均超过0.8，Q2超过0.9，200次置换检验Q2超过0.997，模型稳健无过拟合。以VIP > 1、FC ≥ 3或FC ≤ 1/3、P < 0.01为标准筛选差异代谢物：FZBL-2 vs FZBL-1筛选出190种（183上调、7下调），FZBL-1 vs FZBL-3筛选出257种（32上调、225下调），FZBL-3 vs FZBL-2筛选出164种（100上调、64下调）。黄酮醇在差异代谢物中占比最大，其次为黄酮。
3.5 抗氧化活性分析：FZBL-2在多个参数中表现出优异的综合抗氧化能力，可能归因于其高–OH含量和完整芳香结构。黄酮抗氧化活性不仅取决于丰度，更取决于结构特征，包括–OH和甲氧基（–OCH?）的数量和位置、糖基化或酰基化程度以及π共轭程度。FZBL-2中quercetin-3-O-arabinoside、morin-3-O-glucoside和galangin等抗氧化黄酮显著上调。FZBL-1中上调的norartocarpetin和quercetin-3-O-(6″-O-malonyl)glucoside-5-O-glucoside结构复杂， extensive糖链对母核–OH活性位点产生空间屏蔽效应，可能解释其较弱抗氧化活性。
3.6 酶活性抑制分析：FZBL-2对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶抑制效果最强。黄酮中–OH通常增强酶抑制，而–CH?或–OCH?修饰趋于降低抑制活性。FZBL-2富含–OH基团，包括显著上调的quercetin-3-O-arabinoside、cinchonain Id和catechin衍生物。cinchonain具有强效抗氧化、降血糖和抗癌特性。胰脂肪酶抑制效力顺序为黄烷醇（quercetin）> 黄酮（luteolin）> 二氢黄酮（naringin）> 异黄酮（genistein），FZBL-2对胰脂肪酶抑制最强，与其富含黄酮醇和富羟基黄酮一致。代谢组学显示FZBL-2中kaempferol-3-O-rutinoside（nicotiflorin）和catechin衍生物显著富集，这些黄酮可通过氢键和π-π相互作用与酶活性位点结合。
3.7 抗增殖活性分析：FZBL-2对HuH-7细胞抑制效果最强（IC??最小），其次为FZBL-3。黄酮抗癌活性与–OH数量和位置密切相关。FZBL-2中catechin衍生物和nicotiflorin富集，catechin衍生物可通过调节活性氧、抑制NF-κB信号和诱导凋亡等多机制发挥抗癌作用。FZBL-3对SGC-7901和MDA-MB-231细胞抑制最强，可能与其tiliroside、afzelin、poncirin和aromadendrin等化合物显著上调有关。tiliroside可抑制MDA-MB-231细胞增殖，afzelin可抑制同源细胞系迁移，poncirin可通过FasL上调和caspase-8/-3激活诱导胃癌细胞凋亡，aromadendrin对乳腺癌和胃癌细胞具有强生长抑制活性。
3.8 相关性分析：以相关系数R2 > 0.9和P < 0.05为标准筛选与生物活性高度相关的代谢物。FZBL-2 vs FZBL-1中CDD、cinchonain Id、kaempferol-3-O-(6″-Malonyl) glucoside-7-O-glucoside、6,7-dimethoxy-4-chromanone和quercetin-3-O-(6″-O-malonyl) glucosyl-5-O-glucoside与体外生物活性显著相关。CDD与抗氧化、酶抑制和抗癌细胞增殖活性均显著相关（P < 0.05）。cinchonain Id与抗氧化活性极显著相关（P < 0.01），与酶抑制和抗癌细胞增殖活性显著相关（P < 0.05）。kaempferol glycosides（kaempferol triglucoside和HKDG）与三种活性均极显著相关（P < 0.01）。
讨论部分总结：本研究通过USAE结合RSM优化FZBL提取工艺，最大提取率21.05%。纯化后的FZBL-1、FZBL-2和FZBL-3组分具有不同的代谢物谱和生物活性。FZBL-2表现出强抗氧化、抗脂质过氧化、酶抑制和抗癌细胞增殖活性，这些活性与CDD、cinchonain Id、kaempferol triglucoside和HKDG等化合物高度相关。研究局限性包括缺乏非超声对照、声学表征、生物实验仅为体外性质以及肿瘤/非肿瘤细胞选择性评估。未来研究将聚焦于设置对照组、测定传递声功率、表征空化行为、评估能耗以及定量黄酮化合物，以支持花椒叶的高值化利用。此外，USAE在其他植物材料中的普遍适用性和实用性及其在工业和食品应用中的经济可持续性有待探索。
研究结论翻译：本研究采用USAE和RSM方法优化FZBL提取工艺，最大提取率达21.05%。纯化的FZBL组分命名为FZBL-1、FZBL-2和FZBL-3，显示出不同的代谢物谱和生物活性。其中，FZBL-2表现出强抗氧化、抗脂质过氧化、酶抑制和抗癌细胞增殖活性，这些活性与CDD、cinchonain Id、kaempferol triglucoside和HKDG等化合物高度相关。尽管本研究采用USAE方法优化了FZBL提取工艺，但缺乏非超声对照、声学表征、生物实验仅为体外性质以及肿瘤/非肿瘤细胞选择性评估。未来研究将聚焦于设置对照组、测定传递声功率、表征空化行为、评估能耗以及定量黄酮化合物，以支持花椒叶的高值化利用。此外，USAE在其他植物材料中的普遍适用性和实用性及其在工业和食品应用中的经济可持续性有待探索。
