《BMC Genomics》：A cell type transcriptome atlas for human pituitary, adrenal, thyroid and minor salivary glands
人类垂体（pituitary）、肾上腺（adrenal）、甲状腺（thyroid）和小唾液腺（minor salivary glands）在内分泌（endocrine）和外分泌（exocrine）调控中具有各自独特而又相互联系的作用，参与全身稳态（systemic homeostasis）、代谢、应激反应和口腔健康的维持。尽管这些腺体十分重要，但与其他组织相比，其在单细胞水平上的转录表征仍然相对有限。具有细胞类型特异性表达的基因通常编码对特化功能至关重要的蛋白质，因此鉴定这些基因对于理解生理学和病理生理学（pathophysiology）具有重要意义。单细胞RNA测序（scRNA-seq）促进了此类基因的分析，但解离诱导的伪影（dissociation-induced artefacts）、方案依赖性的细胞丢失以及数据稀疏性（data sparsity）等问题限制了对某些细胞类型和低表达基因的分析。本研究将整合网络分析（integrative network analysis）应用于包含来自人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺的1400余份批量RNA-seq（bulk RNA-seq）样本的数据集，以预测全基因组范围内细胞类型富集的转录组。跨腺体分析（cross-gland analyses）揭示了功能相关细胞类型（如神经内分泌细胞（neuroendocrine cells））之间的核心转录相似性，而组织亚群分析则揭示垂体促性腺激素细胞（gonadotropes）是性别特异性变异的主要位点。本研究为研究健康和疾病状态下的腺体功能提供了有用的补充资源。
**研究背景**
人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺在维持机体稳态中发挥重要作用。垂体作为其他内分泌器官的中枢调控者，通过下丘脑-垂体反馈环路（hypothalamic–pituitary feedback loops）影响甲状腺和肾上腺活动；肾上腺通过分泌皮质醇（cortisol）、醛固酮（aldosterone）和儿茶酚胺（catecholamines）介导应激反应和电解质平衡调节；甲状腺主要调控代谢；小唾液腺分布于口腔各处，产生含淀粉酶、脂肪酶和黏液分泌物的唾液，支持消化和口腔健康。尽管每种腺体具有特化功能，但它们在一个整合的稳态网络中协同运作。
理解腺体在健康和疾病中的功能需要了解其组成细胞类型的转录图谱。然而，与其他许多组织相比，人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺在大型scRNA-seq数据库（如Tabula Sapiens和CZ CELLxGENE）中代表性不足，通常仅作为肿瘤性或疾病腺体组织研究中的有限对照样本出现。scRNA-seq技术面临特定挑战：组织解离可诱导转录伪影（包括天然微环境丢失及相关应激反应），某些基因可能被低估；某些细胞类型对提取方案敏感，而另一些则需要广泛且具破坏性的蛋白水解消化才能分离；与批量RNA-seq相比，scRNA-seq数据稳定性较差、变异性更大，零值比例高，尤其是对低表达基因；计算方法虽可部分解决丢失率问题，但相关方法仍存争议；此外，多数scRNA-seq研究通常仅处理有限数量供体的样本，增加了低估生物学变异性和膨胀差异表达分析假阳性的风险。
基于此，研究人员将先前开发的整合相关性分析（integrative correlation analysis）应用于批量RNA-seq数据集，生成了人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺的全基因组细胞类型富集转录组图谱。该方法规避了scRNA-seq的关键局限性：无需预先分离细胞，可同时分析数百份样本以减轻生物学变异性，能够鉴定低表达的细胞富集转录本，并可实现有充分统计效力的组间比较。
**关键技术方法**
研究人员从基因型-组织表达（GTEx）项目V10版本获取批量RNA-seq数据，包括垂体（n=313）、肾上腺（n=295）、甲状腺（n=684）和小唾液腺（n=181）样本。针对每种组织样本集，基于内部蛋白质组学分析、文献、scRNA-seq数据及数据库（如Cell Marker和PanglaoDB）为每种主要组成细胞类型选择候选细胞类型特异性标记基因作为参考转录本（reference transcripts，Ref.T.），每种细胞类型选取三个Ref.T.。通过计算Ref.T.与所有其他蛋白编码基因之间的Spearman相关系数，鉴定细胞类型富集基因（标准为：与对应Ref.T.面板的最低平均相关系数>0.5，FDR<0.0001，且与其他Ref.T.面板的最大平均相关系数差异>0.15）。同时采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）作为无偏验证方法。利用超几何检验比较不同数据集间的基因重叠显著性，利用ClusterProfiler进行基因本体（GO）分析，利用STRING进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。性别亚组分析中将GTEx数据按性别注释分为亚群后行相同分析，并采用Fisher z检验计算性别间富集分数差异的显著性。组织蛋白验证采用免疫组织化学（IHC）染色，图像来自人类蛋白质图谱（HPA）。
**研究结果**
**人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺中细胞类型转录组谱的鉴定**
细胞类型参考转录本在未分级RNA-seq数据中具有相关性。研究人员对四种腺体的GTEx批量RNA-seq样本集分别进行分析。以垂体为例，每个样本包含混合细胞类型，贡献不同比例的mRNA转录本。为每种主要组成细胞类型选择候选参考转录本，基于以下标准筛选三个Ref.T.：细胞类型面板内Ref.T.间高相关性（指示细胞类型共表达），如生长激素细胞（somatotropes）[GH1, GHRHR, CD79B平均相关系数±标准差：0.84±0.02]；不同细胞类型面板间Ref.T.低相关性（指示细胞类型特异性），如生长激素细胞与其他细胞类型Ref.T.的最大平均相关系数±标准差：0.19±0.03。
**利用参考转录本分析鉴定细胞类型富集基因**
对每个样本集，计算所选Ref.T.与所有其他测序蛋白编码基因之间的相关系数。由于细胞类型比例因生物学和采样变异性而波动，组成型表达的细胞富集基因之间的比值保持相对一致，主要反映细胞类型富集而非调控网络。因此，给定转录本与仅一个细胞类型面板中所有Ref.T.的高相关性与该细胞类型富集一致。细胞类型富集基因暂定为满足以下条件者：（i）与代表该细胞类型的Ref.T.面板的最低平均相关系数>0.5（所有校正P值<0.001）；（ii）该值与与任何其他Ref.T.面板的最大平均相关系数之间的差异相关性>0.15。后一标准排除了可能同时在多个细胞类型中富集的基因。对于垂体，研究人员还进行了额外分析，将来源于POU1F1谱系的三种相关细胞类型——生长激素细胞、催乳素细胞（lactotropes）和促甲状腺激素细胞（thyrotropes）——在差异相关性排除中互相豁免，以鉴定这些细胞类型之间可能共富集的基因。
**无监督加权网络相关性分析（WGCNA）支持Ref.T.分析**
由于分析基于人工选择的Ref.T.面板，细胞类型分类受输入偏倚影响。因此，研究人员对相同GTEx RNA-seq样本集进行了WGCNA——一种无需人工输入或标记基因选择的无偏方法。WGCNA生成所有转录本之间的相关系数，并根据表达相似性将其聚类为相关组。在每个样本集中，属于同一细胞类型面板的Ref.T.被发现位于同一WGCNA簇中，或位于同一分支或邻近分支的簇中。总体而言，根据上述标准预测为细胞类型富集的大多数基因与相应Ref.T.聚类到同一WGCNA组或邻近分支/相关分支，与分类一致。在少数不符合此情况的细胞类型中（6/47），与Ref.T.面板的平均相关阈值从0.50提高，直至>50%的基因位于邻近分支/相关分支中。尽管研究人员先前的工作表明基于Ref.T.的分析在细胞类型基因富集分析中比WGCNA具有更高灵敏度，但此额外标准用于最小化潜在假阳性。
**基因本体和蛋白质-蛋白质网络分析揭示细胞类型基因连接**
应用上述选择标准后，分类为某一细胞类型富集的基因与同一组织中分析的其他基因良好分离。对预测的细胞类型富集基因进行GO分析，揭示了与组织内已知功能相关的术语的显著富集。例如，生长激素细胞中富集的基因包括与生长激素受体信号传导和肽分泌调控相关的基因；催乳素细胞中包括与突触信号传导和胞吐调控相关的基因；促性腺激素细胞中包括与性别决定和性腺发育相关的基因。STRING蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示了各细胞类型富集基因编码蛋白之间的显著相互作用。
**组织特化细胞类型具有最多富集基因**
每种腺体组织内预测细胞类型富集基因总数从垂体的1525个到肾上腺的3644个不等。在所有情况下，组织特化细胞类型（相对于存在于所有或大多数组织中的"核心"细胞类型，如内皮细胞或免疫细胞类型）具有最高的总体富集基因数：垂体中的内分泌细胞类型（生长激素细胞、催乳素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞（corticotropes）和促甲状腺激素细胞）（836/1525[55%]），肾上腺中的皮质细胞（cortex cells）（2007/3644[55%]）和髓质细胞（medulla cells）（558/3644[15%]），甲状腺中的腺细胞（glandular cells）（1472/2860[51%]），以及小唾液腺中的腺细胞（1131/2734[41%]）。这些特化细胞类型富集基因的高数量反映了其在器官特异性功能中作用的复杂性。
**Ref.T.分析可解析组织富集基因的细胞类型来源**
研究人员整理了在HPA和GTEx数据集中鉴定为组织富集（即相对于其他组织类型在相应组织中表达更高）的基因列表。大多数垂体富集基因与代表五种内分泌细胞类型中一种或多种的参考转录本具有最高相关值。皮质细胞是大多数肾上腺富集基因的预测来源。大多数甲状腺富集基因被分类为主要在腺细胞中表达，而PLVAP和CALCA分别被预测为在内皮细胞（EC）和滤泡旁细胞（parafollicular cells）中富集。大多数唾液腺富集基因主要在腺细胞中表达。LHX8是唯一被分类为在非腺细胞类型（预测在成纤维细胞中富集表达）中富集的唾液腺富集基因。因此，在所有情况下，组织富集基因通常被该分析分类为在组织特化细胞类型中富集。
**单细胞RNA-seq与Ref.T.分析一致**
研究人员从垂体神经内分泌肿瘤研究和散发性垂体腺瘤研究中获取健康对照/未受影响垂体组织数据，以及甲状腺、肾上腺和小唾液腺的scRNA-seq数据。在可用的情况下，还与人类细胞景观（HCL）数据库和Tabula Sapiens联盟数据进行比较。没有任何scRNA-seq数据集包含研究人员分析的所有细胞类型，甲状腺滤泡旁细胞（也称为C细胞）在所有数据集中均缺失，因此无法比较该群体数据。为比较所有数据集间的细胞谱，研究人员使用超几何检验计算重叠显著性。在所有情况下，本研究中预测为细胞类型富集的基因在相应细胞类型的scRNA-seq研究富集基因中过度呈现。这种重叠与scRNA-seq研究之间的重叠相当或更具显著性。对于本研究预测为细胞类型富集的基因，高比例在一个或多个scRNA-seq数据集中被分类为如此（垂体细胞类型总体54%，肾上腺72%，小唾液腺77%，甲状腺76%）。这种复制性与scRNA-seq数据集之间的复制性相当或更好。
**跨组织细胞类型富集基因比较揭示共性**
尽管所分析的每种腺体组织具有自身特化功能和分泌分子，但它们也共享若干功能和机制通路。研究人员比较了不同组织细胞类型之间的富集基因谱，以发现重叠富集。超几何分析鉴定了不同腺体组织中具有显著富集基因谱相似性的细胞类型。正如预期，存在于大多数或所有分析组织中的常见细胞类型（如内皮细胞、巨噬细胞和T细胞）在富集基因方面具有高度显著重叠。来自垂体、小唾液腺、肾上腺和甲状腺的各种组织特化细胞类型也具有共同的富集基因谱。肾上腺皮质III细胞和甲状腺腺细胞II具有最高数量的共享富集基因（n=436）。这些包括具有已知激素合成活性的基因，如FDX1和PGRMC1（先前在肾上腺中报道）、SLC5A8（先前在甲状腺中报道）和NNT（先前在两个组织中均有报道）。其他为较少了解的、未表征的基因，据研究人员所知没有已知注释功能，如C5orf15和TMEM245。这些基因的富集GO术语包括细胞内运输、蛋白质运输和定位以及小分子代谢过程，227/436（52.1%）先前被分类为管家基因（housekeeping genes）。因此，此处的富集表达可能反映这些细胞类型的高分泌及相关代谢需求。SUMO1和DHRS7编码蛋白的染色显示与肾上腺皮质和甲状腺腺细胞中的表达一致。
12个基因在肾上腺皮质细胞II和唾液基底细胞（basal cells）中均被分类为细胞类型富集（p值=2.8×10??）。GO分析显示参与类固醇生物合成和代谢的基因强烈富集，STRING蛋白质-蛋白质相互作用分析显示该基因集编码蛋白之间的显著相互作用（p<1.0×10?1?）。这些包括HMGCR（胆固醇合成的限速酶）以及参与该过程的其他关键基因，包括HMGCS1、MVK、MVD。MVK和SQLE编码蛋白的染色显示与肾上腺皮质和唾液基底细胞中的表达一致。肾上腺具有众所周知的产生类固醇激素供分泌至全身的主要功能，然而这并非小唾液腺的已知功能，小唾液腺通常与分泌富含蛋白质的唾液和唾液酶相关。唾液基底细胞中甾醇/胆固醇代谢特征的存在可能反映与基底/祖上皮生物学相关的高膜和生物合成需求，而非内分泌类固醇生成本身。尽管如此，新兴证据表明唾液腺可能产生少量某些类固醇激素（如皮质酮和睾酮），并可局部代谢循环类固醇激素。进一步研究这一共享基因特征，特别是与局部甾醇处理、上皮更新和潜在胞内分泌类固醇代谢的关系，可能有助于阐明其对唾液腺生物学的功能相关性及对唾液分泌的潜在影响。
30个基因在肾上腺髓质细胞和唾液腺细胞中均被分类为细胞类型富集（p值=9.5×10??）。这些包括CYB561（一种参与抗坏血酸代谢的跨膜电子载体，抗坏血酸是肾上腺髓质中交感神经细胞和嗜铬细胞中多巴胺β-羟化酶活性的必需辅因子）、PPP1R1B（参与多巴胺能神经元信号通路和若干神经系统疾病）和CADPS（一种在神经递质和激素胞吐调控中起作用的膜蛋白）。GO分析显示参与分泌和突触信号传导的基因富集。STRING蛋白质-蛋白质相互作用分析显示这些基因编码蛋白组之间的显著相互作用（p值<0.001）。CYB561和PPP1R1B编码蛋白的组织染色显示与肾上腺髓质细胞和唾液腺细胞中的表达一致。
许多肾上腺髓质细胞富集基因也被预测为在垂体各种内分泌细胞中富集，可能反映激素产生和分泌中的共享作用。肾上腺髓质细胞和催乳素细胞共享最多数量的富集基因（n=39）（p值<1.0×10?1?），包括在分泌调控中具有明确描述作用的基因（如SNAP25、SYN1和PTPRN2）、反映神经内分泌身份的基因（如INA和CELF3）以及参与膜兴奋性的基因（如SCN3B和ASIC4）。相应地，GO分析显示参与突触传递和神经递质分泌的基因富集。STRING分析显示这些基因编码蛋白组之间的显著相互作用（p=2.98×10?1?）。ARHGAP36和PTPRN2编码蛋白的组织染色显示与肾上腺髓质细胞和催乳素细胞中的表达一致。
大多数被分类为在甲状腺滤泡旁细胞中富集的基因也被分类为在肾上腺髓质细胞中富集（17/24[70.1%]）（p值<1.0×10?1?）。该列表中的共富集基因包括参与神经内分泌激素产生的基因，如CHGA、DDC、SYT4、SST和PTPRN。GO分析显示参与蛋白质定位和通过神经肽的突触信号传导的基因富集。STRING分析显示这些基因编码蛋白之间的显著相互作用（p值<1.0×10?1?）。DDC和CPLX2编码蛋白的组织染色显示与甲状腺滤泡旁细胞和肾上腺髓质细胞中的表达一致。
**细胞类型富集转录本中性别特异性差异的预测**
研究人员对垂体（女性n=84，男性n=228）、甲状腺（女性n=225，男性n=440）、肾上腺（女性n=110，男性n=184）和小唾液腺（女性n=52，男性n=129）进行了性别拆分亚组分析，以比较男性和女性的细胞类型富集谱。甲状腺、肾上腺和小唾液腺特化细胞类型的富集谱在性别间基本可比。一些转录本仅在女性或男性中被分类为富集，但大多数具有相对较低的差异相关分数，表明它们仅略低于另一性别中分类为富集的指定阈值。研究人员设定了男/女独有富集基因的鉴定阈值：校正Fisher z检验p值<0.001且差异相关分数（与相应参考转录本相对于另一性别）>0.40。在甲状腺腺细胞（TMSB4Y）、肾上腺髓质和皮质细胞（分别为PCDH11Y和NLGN4Y）以及唾液腺细胞（TBL1Y）中鉴定了少量男性独有细胞类型富集转录本。在每种情况下，转录本均为Y连锁，mRNA表达仅在男性样本中检测到高于背景水平。在甲状腺、肾上腺或小唾液腺的特化细胞类型中未发现女性独有细胞类型富集基因。在垂体中，生长激素细胞、催乳素细胞或促肾上腺皮质激素细胞的基因富集谱之间没有明显的性别差异。促性腺激素细胞具有最高数量的显著差异性别富集基因，其中大多数仅在女性中富集（17个 vs 男性4个）。
最显著的女性独有富集基因包括SHH（一种广泛研究的信号分子，在脑和垂体发育中具有许多重要功能；与促性腺激素细胞Ref.T.[FSHB, LHB, GNRHR]的平均相关系数男性=0.39 vs 女性=0.82，p=5.7×10??）、GAD2（负责产生主要抑制性神经递质GABA；平均相关系数男性=0.40 vs 女性=0.81，p=2.4×10??）、NETO2（一种跨膜红藻氨酸受体，功能与神经元突触传递调控相关；平均相关系数男性=0.23 vs 女性=0.72，p=7.9×10??）和SLC24A2（一种钙/钠离子交换器，也在若干人脑区域表达；平均相关系数男性=0.27 vs 女性=0.74，p=9.5×10??）。虽然SLC24A2未在男性促性腺激素细胞中富集，但在单性别分析中被分类为在男性促甲状腺激素细胞中富集，表明给定基因富集的主要细胞类型可能在性别间变化。在所有情况下，这些女性独有促性腺激素细胞富集基因的平均TPM表达在女性样本中高于男性样本。其他值得注意的女性独有促性腺激素细胞富集基因包括RAMP1（负责调节降钙素基因相关肽（CGRP）受体活性，已知对雌激素和孕激素性激素响应；平均相关系数男性=0.29，女性=0.75，p=1.1×10??）、CHRNA9（一种烟碱型乙酰胆碱受体亚基，已知在垂体中表达并对性激素响应，与听觉处理及酒精和尼古丁成瘾有关；平均相关系数男性=0.32，女性=0.75，p=5.4×10??）和LRAT（对男性和女性生育力均重要，在卵巢、睾丸和下丘脑中的表达显示对FSH信号高度敏感；平均相关系数男性=0.08，女性=0.53，p=3.9×10??）。
男性独有促性腺激素细胞富集基因包括SLC17A3（一种有机阴离子转运蛋白，对肾脏中尿酸排泄重要——该功能已知受性激素影响——以及 other 小有机阴离子和代谢物的转运；平均相关系数男性=0.63 vs 女性=0.13，p=1.3×10??）。密切相关的转运蛋白SLC17A4最近被证明可转运甲状腺素（T4）激素。与SLC17A3相关的SNP与女性尿酸分泌相关但与男性无关，表明性别差异功能。其他显著的男性独有促性腺激素细胞富集基因包括NBPF6（平均相关系数男性=0.59 vs 女性=0.15，p=2.0×10??）和NBPF4（平均相关系数男性=0.63 vs 女性=0.21，p=2.3×10??），两者均为神经母细胞瘤断裂点家族蛋白的未表征成员——功能未表征的转录因子，与神经母细胞瘤和其他若干脑部疾病有关——以及MCF2（一种X连锁鸟苷酸交换因子，与阿尔茨海默病发展和自闭症有性别关联；平均相关系数男性=0.56 vs 女性=0.12，p=4.6×10??）。在所有情况下，这些基因的平均TPM表达在男性样本中高于女性样本。PCDH11Y被分类为男性独有促甲状腺激素细胞富集基因（平均相关系数男性：0.59，女性：0.17，p=6.3×10??）。正如Y连锁基因所预期，表达仅在男性样本中检测到，尽管水平非常低。未发现女性独有促甲状腺激素细胞富集基因。在垂体中分析的其他任何细胞类型中未发现其他性别特异性富集基因。
**讨论部分总结**
研究人员呈现了一个人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺的全基因组细胞类型转录组数据库。该方法基于未分级批量RNA-seq转录组数据分析，规避了scRNA-seq相关的若干挑战，如转录伪影诱导、脆弱细胞类型和稀有转录本分析困难以及测序深度有限。与典型的基于scRNA-seq的分析不同，研究人员分析了大量生物学重复，允许进行有充分统计效力的亚组比较（如女性vs男性）。所有数据可在人类蛋白质图谱（HPA）的Tissue Cell Type部分获取。
肾上腺、垂体和甲状腺均为内分泌腺，将具有全身效应的必需激素分泌至血液中。唾液腺为外分泌腺，将唾液分泌至口腔以润滑和辅助消化。在所有四种组织中，每种腺体内的特化细胞类型显示最大数量的细胞类型富集基因，反映其功能多样性和作用。最能定义组织身份的基因（即在给定组织中相对于其他组织表达更高的基因）在很大程度上是那些在特化驻留细胞类型中富集的基因，如垂体的催乳素细胞和促肾上腺皮质激素细胞，或甲状腺的腺细胞，这与组织富集信号反映关键细胞群体的丰度和转录程序一致。
研究人员观察到腺体间细胞类型富集谱的共性。肾上腺皮质细胞和甲状腺腺细胞共享超过400个富集基因，尽管产生非常不同的内分泌激素。肾上腺皮质是产量最高的内分泌组织，每天产生数十毫克量级的皮质醇及其他类固醇。甲状腺持续产生T4和T3激素，量相对较大（分别约100μg和29μg/天），支持全身代谢。因此，与其他腺体（如垂体，激素产生量小得多）相比，两者均为特别高容量的内分泌组织。因此，肾上腺皮质和甲状腺腺细胞之间的共享基因可能反映高容量激素产生所需的分泌、生物合成和代谢通路的沉重需求。与此一致，预测在两者中富集的基因中超过50%与此类"管家"过程相关。因此，与其他细胞相比，高度代谢或转录活跃的细胞类型可表达更高水平的"普遍表达"基因，如核糖体或线粒体基因。这种效应在癌症中可能尤为明显，其中所谓的"超转录"可掩盖较低表达水平的基因并遮蔽整体转录水平较低的细胞。
大多数预测在甲状腺滤泡旁细胞中富集的基因也被预测在肾上腺髓质细胞中富集，提示共享生物学特征；两者均为具有神经嵴发育起源的神经内分泌细胞类型。甲状腺滤泡旁细胞主要以分泌降钙素（由CALCA编码）而闻名，降钙素通过抑制破骨细胞功能和降低循环钙浓度参与钙稳态。相比之下，肾上腺髓质细胞分泌介导经典"战斗或逃跑"反应的儿茶酚胺（肾上腺素和去甲肾上腺素）。尽管激素输出不同，两种细胞类型均依赖受调控的钙依赖性胞吐进行刺激-分泌耦合，钙/胞吐相关GO术语在共享富集基因中过度呈现。这些共享特征可能在多发性内分泌腺瘤病2型（MEN2）中具有临床相关性，该病由RET基因的遗传性致病变异引起。MEN2与起源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌高风险相关，约50%病例出现起源于肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤。此处鉴定的共富集基因可能为MEN2肿瘤发生的共享神经内分泌程序和机制提供见解。值得注意的是，一个共享富集基因DDC（L-DOPA脱羧酶）参与儿茶酚胺生物合成，已被报道在甲状腺髓样癌中上调。
所有分析的垂体分泌细胞类型均与肾上腺髓质细胞共享一些富集基因。GO分析显示在神经递质/囊泡运输和受调控分泌相关过程上的汇聚。与通过脊髓直接神经支配的肾上腺髓质不同，腺垂体主要通过下丘脑-垂体门脉循环调控，将下丘脑释放和抑制因子递送至垂体内分泌细胞。这些下丘脑神经分泌神经元可产生动作电位并调节分泌。尽管控制方式不同，控制电兴奋性和刺激-分泌耦合的核心机制高度保守。此处鉴定的一些共富集基因可能反映共享的兴奋-分泌机制，并可能在这些过程中具有目前未知的作用。
在该分析中，预测的性别差异在垂体中最明显，特别是在促性腺激素细胞中，显示相对较多的女性独有细胞类型富集基因。这在生物学上合理，因为促性腺激素细胞身份和活动与性类固醇反馈和生殖轴动态紧密耦合。相比之下，定义肾上腺、甲状腺和小唾液腺主要细胞类型的基因主要反映核心保守功能程序，这些程序在性别间基本共享。Sonic hedgehog（SHH）在垂体中显示最显著的性别间差异，仅在女性中促性腺激素细胞富集。SHH是一种重要的发育信号分子，尤其对脑和垂体模式化至关重要，但先前将SHH与垂体生物学联系的研究主要集中在其在促肾上腺皮质激素细胞中的表达而非促性腺激素细胞。然而，近期研究与本研究结果一致，SHH被报道在鸡促性腺激素细胞和小鼠促性腺激素细胞前体中富集。女性垂体样本中SHH水平高于男性样本，可以推测，由于女性垂体组织在生殖状态间经历动态适应，这种SHH信号可能反映女性促性腺激素细胞转录状态增加的塑性/适应性。尽管据研究人员所知，促性腺激素细胞中性别差异SHH表达的直接临床意义尚未见报道，但SHH性别关联已在其他情境中报道，如SHH亚型髓母细胞瘤在某些队列中显示性别差异，女性据报道生存率低于男性。在垂体中，Hedgehog/GLI通路活性已在腺瘤生物学中报道，但性别分层分析仍然有限。最显著的差异男性独有富集基因也在促性腺激素细胞中：SLC17A3，一种有机阴离子转运蛋白。男性垂体样本中SLC17A3水平高于女性，与男性促性腺激素细胞中特异性升高表达一致。男性和女性促性腺激素细胞输出组织方式不同（紧张性vs周期/ surge模式），促性腺激素细胞生物合成程序受促性腺激素释放激素脉冲动态强烈塑造。垂体分泌与离子通道活性/Ca2?信号紧密耦合，可以推测转运蛋白（如SLC17A3）的性别连锁富集可能反映促性腺激素细胞分泌状态或细胞代谢物处理的差异——尽管SLC17A3在垂体激素分泌中的直接作用尚未确立。
**研究局限性**
本研究未分析特定细胞亚型；概念上可以这样做，但缺乏关于细胞亚型身份的统一共识带来挑战。例如，在人类垂体scRNA-seq研究中，促性腺激素细胞可显示转录异质性，并经常被分类为亚群，最常沿黄体生成素（LH）vs卵泡刺激素（FSH）偏向轴分类，尽管这很可能代表功能状态而非实际细胞亚型。因此，选择亚型Ref.T.用于分析模型输入或解释WGCNA具有挑战性。因此，虽然分类可告知细胞类型限制性表达，但不能区分由给定类型所有细胞表达的基因与仅在给定亚群中表达的基因。基因可能在同一组织内的相关细胞类型之间共富集，如垂体中的POU1F1谱系生长激素细胞、催乳素细胞和促甲状腺激素细胞。然而，本研究聚焦于在单个细胞类型中富集的基因，未广泛分析此类共富集基因。由于缺乏良好的细胞类型特异性标记作为合适的Ref.T.，一些细胞类型未在分析中被分析。因此，一些预测的细胞类型富集基因也可能在其他未分析的细胞类型中表达，这一局限性同样适用于scRNA-seq组织数据集，这些数据集经常缺乏某些组成细胞类型的数据。基因表达可受遗传、表观遗传、环境或生理因素（如年龄）修饰。此类基因可能因独立于细胞类型比例的表达变异而与Ref.T.不相关，导致分析中的假阴性，然而已有研究表明细胞类型组成是批量RNA-seq数据中基因变异的主要 cause。GTEx数据集中男性样本相对于女性样本过度呈现，可能使分析偏斜。然而，研究人员也进行了基于性别亚组的分析和后续比较，使用考虑样本量的Fisher z分数统计检验。研究人员使用了高阈值将基因分类为细胞类型富集，可能导致一些基因被错误排除。例如，S1PR1和CD93是跨组织床的内皮富集基因，但在本研究中分别低于甲状腺和肾上腺分类阈值。然而，在两种情况下，富集分数在内皮细胞中最高；因此，分类仅作为参考，读者应逐基因考虑数据。
**研究结论翻译**
本研究将整合相关性分析应用于来自人类垂体、肾上腺、甲状腺和小唾液腺的1400余份批量RNA-seq样本，生成了全基因组细胞类型富集转录组图谱。跨腺体分析揭示了功能相关细胞类型之间的核心转录相似性，如肾上腺髓质细胞与垂体催乳素细胞及甲状腺滤泡旁细胞等神经内分泌群体之间的共享基因富集特征。性别分层分析鉴定垂体促性腺激素细胞为男女性转录差异最显著的细胞类型。本研究为研究健康和疾病状态下的腺体功能提供了有用的补充资源，所有数据可在人类蛋白质图谱（HPA）网站的Single Cell Resource部分获取。
