埃及首株多重耐药柯氏柠檬酸杆菌DFU32基因组及耐药组比较分析

《BMC Microbiology》：Comparative genomic and resistome analysis of Citrobacter koseri: first genome report from Egypt

　　

背景 柯氏柠檬酸杆菌（Citrobacter koseri）在医疗和社区相关感染中的涉及日益增多，多重耐药（MDR）菌株构成日益增长的临床关注。然而，其种群结构和耐药组动态仍未得到充分理解。本研究报道了来自埃及的首株多重耐药 C. koseri 分离株（DFU32）的基因组草图序列，该菌株分离自一名糖尿病足溃疡（DFU）患者。研究人员还基于当时可获得的518个公开 C. koseri 基因组进行了比较基因组和耐药组分析。 结果 该分离株对多种抗菌药物类别表现出耐药性，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磺胺类药物，以及对替加环素和粘菌素的耐药。多位点序列分型（MLST）将DFU32归入序列型（ST）1172。基因组分析鉴定出21个抗菌药物耐药（AMR）基因，包括多种β-内酰胺酶基因（blaCKO、blaTEM、blaOXA?9、blaCTX?M?15 和 blaCMY?2）以及氨基糖苷类耐药决定因子，包括 armA。粘菌素耐药与PhoQ V381I氨基酸替换的存在相关。对518个公开基因组的比较分析揭示了该物种共存在140个独特的AMR基因，其中73.6%的基因组携带获得性耐药决定因子。该种群包含两个主要谱系，即 blaCKO 和 blaMAL 谱系，其中MAL谱系（尤其是MAL-2）携带显著更多的AMR基因。碳青霉烯酶基因在29.1%的基因组中被鉴定，分布于近一半检测到的ST中，以 blaKPC 变体为主。可移动粘菌素耐药（mcr）基因在2.5%的基因组中被检测到。碳青霉烯酶和 mcr 基因均主要定位于质粒相关重叠群上。值得注意的是，观察到了染色体整合事件，包括与IS26和IS903B相关的 mcr-9.1，以及嵌入IS26侧翼转座子（IS26–recA–ISKpn27–blaKPC?2–ISKpn6–IS26）中的 blaKPC?2，出现在新型ST中。这些发现强调了 C. koseri 的基因组可塑性以及粘菌素和碳青霉烯耐药性稳定、不依赖质粒维持的潜力。在鉴定出的ST中，ST690表现出特别高的耐药基因负荷，包括碳青霉烯酶和 mcr 基因，提示其可能代表一个高风险谱系。 结论 本研究提供了来自埃及的MDR C. koseri 分离株的首个基于基因组的特征描述。结果突显了该新兴病原体中AMR决定因子的遗传流动性和全球传播潜力。值得注意的是，所研究的分离株来自DFU，强调了 C. koseri 在慢性伤口感染中日益增长的临床相关性。

一、研究背景与意义

糖尿病足溃疡（DFU）是复杂的多微生物感染环境，可容纳多种此前未被充分认识的细菌物种。柯氏柠檬酸杆菌（Citrobacter koseri）是一种革兰阴性、杆状、兼性厌氧菌，属于柠檬酸杆菌属，常见于人类胃肠道正常菌群中，也存在于土壤、水和多种食物来源中。该菌可通过受污染的食物或水、粪-口途径或直接的人-人接触传播，尤其在医疗机构环境中。尽管被视为低毒力机会性病原体，C. koseri 仍可导致严重感染，尤其在免疫功能低下个体、新生儿和儿童中，与脓毒症、脑膜炎和脑脓肿等侵袭性感染相关，估计死亡率为33%，近半数存活者出现长期神经并发症。新生儿重症监护病房的反复暴发进一步凸显了其在高度脆弱人群中的医院获得性传播潜力。

近年来，C. koseri 已从对一线抗生素大体敏感的状态转变为呈现日益复杂耐药模式的菌株，常携带多种可移动遗传元件和染色体突变，降低β-内酰胺类（包括超广谱头孢菌素和碳青霉烯类）的疗效。最近，耐药性已扩展至粘菌素等最后防线药物。印度监测研究显示柠檬酸杆菌相关菌血症从2016年的12%上升至2022年的24%，其中 C. koseri 约占所有柠檬酸杆菌菌血症病例的72%。鉴于 C. koseri 感染发病率的上升和临床意义的增加，本研究旨在调查一株多重耐药（MDR）C. koseri 分离株的基因组特征——这是埃及报道的首个该物种基因组草图——并与分析时美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因组数据库中所有518个完整和草图 C. koseri 基因组进行全面的耐药组比较。

二、研究设计与技术方法

研究人员从2024年3月入住埃及开罗国家糖尿病和内分秘研究所的一名48岁女性糖尿病患者的感染性糖尿病足溃疡中分离出 C. koseri 菌株DFU32。采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行表型药敏试验，粘菌素采用肉汤微量稀释法。全基因组测序（WGS）采用DNBseq?短读长测序技术（PE150），使用Unicycler v0.4.8进行从头组装，QUAST和CheckM2评估组装质量，NCBI原核基因组注释流程（PGAP）进行注释。多位点序列分型（MLST）使用FastMLST，基于七个管家基因（aspC、clpX、fadD、mdh、arcA、dnaG、lysP）。系统发育分析采用Snippy v4.0.2进行单核苷酸多态性（SNP）检测，Gubbins v3.4.3识别同源重组，IQ-TREE和RAxML-NG构建进化树。耐药基因鉴定采用AMRFinderPlus和NCBI NDARO数据库，质粒分析使用MOB-suite和PlasmidFinder，毒力基因分析结合VFanalyzer、ABRicate和VirulenceFinder三种工具。

三、主要研究结果

DFU32的表型药敏特征：DFU32表现出MDR表型，对阿莫西林/克拉维酸、超广谱头孢菌素（头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟）、氨基糖苷类（庆大霉素、阿米卡星）、四环素、替加环素、氯霉素、呋喃妥因和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑不敏感。粘菌素最低抑菌浓度（MIC）≥512 μg/mL，表明高水平耐药。但对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、美罗培南、环丙沙星和磷霉素保持敏感。

DFU32基因组组装与注释：基因组组装包含60个重叠群，总长5,196,771 bp，GC含量52.99%，N50为462,353 bp，基因组完整性100%。PGAP注释共鉴定5,024个基因，包括4,932个编码序列（CDS）。MOB-suite分析未将任何重叠群分类为质粒，但四个重叠群携带质粒相关特征。

种群分析与系统发育定位：DFU32被归入ST1172。518个公开基因组包含48个不同ST，58株（11.2%）携带新等位基因，28株（5.4%）显示未报道的等位基因谱。最常见的ST为ST854（32.6%）、ST64（12.4%）和ST862（6.2%）。Gubbins分析显示重组对核苷酸变异的贡献低于点突变（r/m比值为0.2）。SNP分析表明DFU32与美国2019年分离株CB00152（同为ST1172）仅相差22个核心SNP，与美国2014年菌株NCTC10849相差23个SNP。

DFU32毒力组：三种检测工具联合分析揭示了24个毒力因子（VF）类别的广泛毒力基因谱，VFanalyzer鉴定216个基因。最主要的VF类别为铁摄取（48个基因）和黏附相关因子（39个基因），还包括生物膜形成、外排泵、趋化性和运动性、毒素、侵袭等功能。

DFU32耐药组：AMRFinder鉴定出21个AMR基因，潜在赋予至少十种抗菌药物类别耐药。氨基糖苷类耐药基因最丰富（33.3%），其次是β-内酰胺类（23.8%）。粘菌素耐药与PhoQ V381I替换相关，未在 pmrCAB 操纵子、phoP、脂质A生物合成基因或 mgrB 中发现突变。gyrA 检测到Y211H错义突变，位于喹诺酮耐药决定区（QRDR）之外。多个AMR基因共定位于相同重叠群上，包括 floR、tet(A)、aph(6)-Id、aph(3'')-Ib、sul2 于重叠群25；qacEΔ1、sul1、armA、msr(E)、mph(E) 于重叠群26。fosA7 基因位于57,414 bp的整合性接合元件（ICE）内，整合于染色体附着位点。

物种耐药组分析：C. koseri 基因组中共鉴定140个耐药基因，赋予至少14类抗菌药物耐药。73.6%的基因组携带获得性耐药决定因子。种群分为 bla_CKO（47.6%）和 bla_MAL（51.3%）两个主要谱系，MAL谱系（尤其MAL-2）携带显著更多的AMR基因。磷霉素耐药基因变体为第二常见（44.8%）。碳青霉烯酶基因在29.1%的基因组中检测到，分布于近一半ST中，以 bla_KPC 变体为主。mcr 基因在2.5%的基因组中检测到。单个菌株中最多共存26个AMR基因。

不同ST中耐药基因分布：在代表性超过五个基因组的ST中，ST901、ST1169、ST1145和ST690表现出最高的耐药基因负荷。ST690为携带最多碳青霉烯酶基因（n=37）的优势谱系，主要为 bla_KPC（n=24），其次为 bla_NDM（n=7）和 bla_OXA?48（n=3）。ST854为第二大谱系（n=30），显示更多样的碳青霉烯酶谱。mcr 基因在九个ST中检测到，ST690为优势谱系（4株阳性）。

碳青霉烯和粘菌素耐药基因的遗传环境：碳青霉烯酶和 mcr 基因主要位于质粒相关重叠群上（82%），主要复制子类型为IncN2（8.8%）、IncL/M和repB（各8.0%）。mcr-9.1 在日本两株ST690菌株（TUM3761和IR025）的染色体上被鉴定，嵌入由IS26和IS903B侧翼的转座子中，位于 bla_CTX?M?2 基因上游。该转座子与 Salmonella enterica 质粒pXXB1403具有100%同一性。bla_KPC?2 在中国2023年两株新型ST菌株（K2521和K2721）的染色体上被鉴定，嵌入IS26侧翼转座子中，每株存在两个拷贝，与 Klebsiella pneumoniae 质粒pKPC-DD02201区域具有100%覆盖率和100%同一性。

四、讨论与结论

本研究报告了埃及首株来自DFU患者的 C. koseri 基因组，该分离株表现出MDR表型，对粘菌素和替加环素等最后防线药物不敏感。DFU32携带多种毒力决定因子，包括I型和III型菌毛、IV型菌毛、大肠杆菌常见菌毛（ECP）和卷曲纤维，可能促进宿主组织黏附和慢性伤口中的生物膜形成。铁摄取系统（包括气杆菌素、肠杆菌素和血红素摄取决定因子）和高致病性岛（HPI）可能增强细菌在宿主营养免疫铁限制条件下的适应性。

DFU32携带至少五种β-内酰胺酶基因和七种氨基糖苷类耐药基因，包括广谱耐药决定因子 armA。尽管携带 fosA7 和 qnrS1，该菌株对磷霉素和环丙沙星保持表型敏感，支持重新利用旧抗生素的兴趣。粘菌素耐药与 phoQ V381I替换相关，但该替换也存在于同ST的另一菌株CB00152中，其因果作用需功能验证。

物种水平分析揭示了 C. koseri 种群分为 bla_CKO 和 bla_MAL 两个主要谱系，MAL谱系（尤其MAL-2）携带更多AMR基因。碳青霉烯酶基因在29.1%基因组中分布，bla_KPC 变体为主，反映肠杆菌目中碳青霉烯耐药的全球趋势。质粒在耐药基因传播中占主导地位，但 mcr-9.1 和 bla_KPC?2 的染色体整合事件表明耐药性可稳定、不依赖质粒地维持。ST690被识别为高风险谱系，携带最多碳青霉烯酶和 mcr 基因。地理分布分析显示 bla_KPC?2 主要见于中国菌株，bla_KPC?3 多见于美国，bla_NDM?1 主要来自新加坡，bla_OXA?48、bla_GES?24 和 mcr-9.1 多与日本菌株相关，但这些模式可能反映WGS数据的可用性而非真实全球分布。

研究结论：本研究提供了来自埃及的MDR C. koseri 分离株的首个基于基因组的特征描述。结果突显了该新兴病原体中AMR决定因子的遗传流动性和全球传播潜力。值得注意的是，所研究的分离株来自DFU，强调了 C. koseri 在慢性伤口感染中日益增长的临床相关性。