基于低覆盖度全基因组测序的瑞典Tyresta国家公园西部松鸡（*Tetrao urogallus*）非损伤性采样基因组与食性研究

《Conservation Genetics》：Genomic and dietary insights from non-invasive sampling of western capercaillie in Tyresta National Park (Sweden)

　　

西部松鸡（*Tetrao urogallus*）作为北方森林专性物种，因栖息地丧失、破碎化及隔离，在瑞典南部出现显著种群下降。Tyresta国家公园及周边森林承载着该地区仅存的南部残余种群之一，然而其遗传健康、种群结构及食性生态学所知甚少。本研究对272份非损伤性采集样本（羽毛与粪便）进行低覆盖度全基因组测序（lcWGS），以全面评估该种群状况。羽毛样本产生了高质量基因组数据，可用于性别鉴定、全基因组杂合度估计、纯合子连续片段（ROH）分析及亲缘关系推断。Tyresta种群的杂合度水平与其他欧洲西部松鸡种群相当，近交水平总体较低，但若干个体表现出长ROH片段，提示近期存在近亲交配。种群结构分析揭示该种群为一个遗传上独特的隔离单元，并可能存在雌性偏倚的扩散模式。亲缘关系分析揭示了一个高度互联的社会网络，雄性平均拥有更多亲属。基于基因型匹配的重捕模拟估计当前最大种群规模为145–215只个体。粪便宏基因组分析揭示了多样化的食谱，包括蓝莓、越橘和桤木等关键植物物种，以及对雏鸟发育至关重要的多种无脊椎动物。尽管该种群目前遗传状况尚属稳健，但Tyresta种群规模小、隔离度高，面临近交衰退风险。保护工作应优先维持栖息地质量、促进基因流（如保护通往邻近种群的迁徙廊道），并确保丰富的森林无脊椎动物群落以支撑种群韧性。

研究背景方面，西部松鸡（*Tetrao urogallus*）作为欧洲最大的松鸡科鸟类及北方和山地针叶林的旗舰物种，在瑞典主要依赖老龄松树（*Pinus sylvestris*）和云杉（*Picea abies*）林，需要结构复杂的栖息地镶嵌体，包括用于栖息的密集覆盖、用于求偶场（lek）的开阔地面以及以蓝莓（*Vaccinium myrtillus*）为食的多样化林下植被。然而，由于栖息地破碎化、森林管理实践、气候变化及人为干扰加剧，该物种在其分布区内经历了急剧下降，导致种群连通性降低、隔离加剧，在瑞典南部等破碎化景观中尤其令人担忧。Tyresta国家公园位于斯德哥尔摩郊外，是瑞典南部仅存的少数老龄北方森林斑块之一，部分森林从未被砍伐，树木树龄可达350年。尽管毗邻城市区域，Tyresta仍支撑着一个规模小且隔离的松鸡种群，其长期存续能力不确定。1999年的一场毁灭性野火烧毁了450公顷核心区域，破坏了关键栖息地和求偶场，可能大幅减少了种群数量。理解Tyresta松鸡种群的状态和遗传健康对于指导本地保护策略和更广泛的恢复努力至关重要。传统监测方法如捕获标记个体在后勤上困难、成本高昂且可能对该隐蔽敏感物种造成伤害，非损伤性遗传采样（利用脱落羽毛和粪便）提供了一种强有力的替代方案，但此类样本通常DNA量低且降解、受环境微生物DNA污染严重， complicate了基因组分析。高通量测序和生物信息学的进步极大提高了从低质量非损伤性样本中恢复全基因组数据的能力，特别是低覆盖度全基因组测序（lcWGS）已成为一种经济有效的方法。本研究应用lcWGS对Tyresta国家公园及周边272份非损伤性采集的松鸡样本进行分析，目标包括：（1）评估不同样本类型（羽毛和粪便）生成基因组数据的效率；（2）通过量化全基因组杂合度和近交水平评估种群遗传健康；（3）调查公园内的种群结构和连通性；（4）重建亲缘关系以推断种群内的亲缘模式和潜在家族结构，此外还探索粪便样本的宏基因组内容以推断食谱组成。

研究人员开展的研究显示，羽毛样本通常比粪便样本产生更高的常染色体覆盖度，许多羽毛样本达到5X以上覆盖度，部分超过10X，而大多数粪便样本保持在5X以下。尽管非损伤性样本覆盖度低且变异大，研究人员仍能通过计算Z染色体与常染色体测序深度比值可靠确定个体性别，雄性（ZZ）比值约1.0，雌性（ZW）比值约0.5，该方法即使在内源DNA含量极低的样本中也有效，并发现一个个体的比值约2.0提示潜在染色体非整倍性。遗传多样性和近交分析方面，对于具有足够基因组数据的个体，常染色体杂合度范围约为0.0025至0.0095，Tyresta种群的杂合度水平与其他欧洲种群的外群个体相当。通过量化ROH总长度评估近交水平，Tyresta种群总体表现出低水平近交，ROH分布与来自奥地利、保加利亚和斯洛伐克的外群种群相似，然而少数个体（包括雄性和雌性）表现出显著的长ROH片段（>1 Mb），表明近期亲本亲缘关系。种群结构和亲缘关系方面，主成分分析（PCA）表明Tyresta大多数个体形成单一相对均匀的遗传簇，但16个个体与主群略有分离，Tyresta簇与来自保加利亚、斯洛伐克/奥地利以及瑞典J?mtland的另一外群种群明显不同，Tyresta种群内部未观察到明显亚结构，尽管若干个体（其中75%为雄性）表现为轻微离群，可能代表近期迁入者。线粒体DNA单倍型分析进一步支持这一发现，显示没有深度分化的母系谱系的互联网络，与单一凝聚种群一致。亲缘关系分析识别了大量关系，包括相同个体（即重捕）、亲子对（一级）、全同胞（二级）和更远亲属（三级），网络分析显示个体间存在广泛的三级以内连接，确认种群高度互联。除11个个体外，其余192个个体在数据集中至少有一个三级以内亲属，平均个体约有8个三级以内亲属，若干个体拥有超过20个亲属。比较不同性别的亲属数量，雄性在公园内平均拥有略多于雌性的亲属数（8.5±6.86 vs. 7.6±7.61），但差异不具统计学显著性。空间分析显示，相同雄性个体大多彼此相距1 km以内，提示该距离可能近似雄性领域大小，但一些离群个体相距可达5 km。在相关个体中，雌性倾向于比雄性距离更近，与性别偏倚扩散一致，平均而言雄性亲属比雌性亲属分布更远。种群规模估计方面，通过基因匹配识别相同个体确定重捕率，成功基因分型的个体中55.5%被采样一次，26.0%被采样两次，18.5%被采样三次或以上。基于这些重捕频率模拟不同种群规模的预期重捕分布，N=180在所有三个统计指标上达到最小偏差，N=200为第二接近拟合，线性插值估计种群大小约为188只个体（95% CI=145–215）。宏基因组食谱分析方面，粪便中检测到的植物DNA确认成年松鸡依赖关键北方森林物种，属水平分析显示植物来源序列以松科和杜鹃花科为主，最丰富的属为松属（>30%平均相对丰度），伴随云杉属（~0.8%）和越橘属（~0.4%）的持续检测。此外还检测到多种无脊椎动物属，主要跨越鳞翅目、鞘翅目、双翅目和毛翅目，包括丰富的鳞翅目属（如Eupithecia、Erebia、Mythimna、Idaea、Xestia、Agrotis、Catocala、Lymantria），地表活动甲虫（Harpalus、Pterostichus、Phosphuga）和芫菁科（Cantharis），反映了松鸡的机会主义觅食行为。叶绿体分析显示Tyresta粪便以针叶树（松属平均84.4%）和杜鹃花科灌木（越橘属平均13.4%）为主，与挪威比较样本中Micranthes（平均44.2%）和Juniperus（平均10.3%）较高丰度形成对比。季节性动态显示春季针叶树物种（云杉和松）代表性增加，而越橘等浆果植物在季节后期丰度更高。

关键技术方法方面，研究团队在2022年2月至6月由熟悉松鸡种群的专职野外人员在整个研究区域非损伤性采集272份样本（脱落羽毛和粪粒），羽毛遍布研究区采集，粪粒仅在求偶场采集作为羽毛采样的补充。样本采集后当日于?20°C冷冻，干冰运输至乌普萨拉大学后于?80°C保存至DNA提取。羽毛DNA提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit配合用户开发方案并稍作修改，大型翼羽或尾羽纵向剖开以获取腋动脉血细胞残余。粪便DNA提取使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit按制造商方案及Vallant et al.（2018）所述程序修改后进行。测序文库在乌普萨拉SNP&SEQ技术平台使用内部开发的SPLAT方案（排除亚硫酸氢钠转化）从0.001–100 ng DNA制备，在SciLifeLab国家基因组平台Uppsala使用NovaSeq X Plus系统、10 B流动槽和XLEAP-SBS测序化学进行双端150 bp测序。此外纳入先前发表的松鸡基因组测序数据（ENA: PRJEB58761）来自奥地利（n=5）、保加利亚（n=5）、斯洛伐克（n=4）和瑞典北部（n=1）作为比较外群。所有原始读段通过统一生物信息学流程处理：使用AdapterRemoval v2.3.4去除接头和低质量碱基，使用bowtie2 v.2.5.4以–very-sensitive设置比对到松鸡参考基因组（bTetUro1.1），丢弃长度低于40 bp或比对质量低于20的读段，使用samtools v1.20 markdup过滤PCR重复。通过计算内源DNA百分比和全基因组平均测序深度评估样本质量，272份样本中203份测序覆盖度高于0.25X并进一步分析。使用bcftools v1.20调用SNP，排除性染色体，过滤超过两个等位基因、插入缺失、缺失数据超过50%及最小等位基因计数低于5的位点。使用MIA组装线粒体基因组，以西部松鸡参考线粒体基因组（OX596333.1）为指导。使用Beagle v5.5对覆盖度高于0.25X的所有个体进行基因型填补，使用bcftools v1.20 roh识别ROH并按长度分类。使用emu v1.2.1进行PCA，使用ANGSD v0.940 -dofasta获取线粒体共识序列，使用PopArt构建单倍型网络。使用READ v2.1.1进行亲缘关系分析，使用ANGSD v0.940调用随机等位基因并转换为plink格式。种群规模估计通过Python模拟种群大小10至400个体，从每个模拟种群随机采样203只鸟（有放回），重复10,000次，记录个体重采样频率并与实证观察比较，使用TVD、SSE和χ2rel三种差异度量评估候选种群大小。粪便样本中未比对到松鸡基因组的读段用于宏基因组分析，使用kraken2 v2.14和微生物GTDB数据库（v11-RS232）过滤 putative微生物读段，再使用Kraken2对完整NT数据库（v20240530）分类，使用Bracken重新估计分类群丰度。非宿主读段还使用Bowtie2比对到15,235个完整叶绿体基因组数据库，保留比对质量高于19的最佳匹配，并过滤与参考序列差异超过5%的读段。

研究结果方面，测序产量和样本质量部分，从272份非损伤性采集样本中成功获得203份覆盖度高于0.25X的低覆盖度全基因组测序数据，羽毛样本通常比粪便样本产生更高的常染色体覆盖度。尽管非损伤性样本覆盖度低，基因分型相关质量指标（测序错误率、GC含量和读段比对质量）在Tyresta队列与公共参考基因组之间无显著差异。通过Z染色体与常染色体测序深度比值可自信确定个体性别，该方法即使在极低内源DNA含量样本中也有效，并发现一个个体具有潜在染色体非整倍性（比值约2.0）。遗传多样性和近交部分，Tyresta种群杂合度水平与其他欧洲种群外群个体相当，总体近交水平低，ROH分布与奥地利、保加利亚和斯洛伐克外群种群相似，但少数个体表现出显著长ROH片段（>1 Mb），表明近期亲本亲缘关系。种群结构和亲缘关系部分，PCA表明Tyresta大多数个体形成单一相对均匀遗传簇，但16个个体略有分离，Tyresta簇与保加利亚、斯洛伐克/奥地利及瑞典J?mtland外群种群明显不同，种群内部无明显亚结构，若干个体（75%为雄性）为轻微离群可能代表近期迁入者，线粒体DNA单倍型网络显示互联网络无深度分化母系谱系。亲缘关系分析识别大量关系包括相同个体、亲子对、全同胞和更远亲属，网络分析显示个体间广泛三级以内连接，除11个个体外其余192个个体至少有一个三级以内亲属，平均个体约8个三级以内亲属，若干个体超过20个亲属。雄性平均拥有略多亲属但差异不显著。相同雄性个体大多相距1 km以内提示雄性领域大小，但一些离群个体相距可达5 km。相关雌性倾向于比雄性距离更近，平均雄性亲属比雌性亲属分布更远。种群规模估计部分，55.5%个体采样一次，26.0%采样两次，18.5%采样三次或以上，N=180在所有三个统计指标上达到最小偏差，N=200第二接近，线性插值估计种群大小约188只个体（95% CI=145–215）。宏基因组食谱分析部分，粪便植物DNA确认成年松鸡依赖关键北方森林物种，属水平以松科和杜鹃花科为主，最丰富属为松属（>30%），伴随云杉属（~0.8%）和越橘属（~0.4%），还检测到栎属和梣属等较低丰度植物属，但风媒花粉沉积是表面采集鸟类粪便中外源环境DNA的已知来源，外来或非北方植物属检测可能反映参考数据库偏差或污染。无脊椎动物属主要跨越鳞翅目、鞘翅目、双翅目和毛翅目，包括丰富鳞翅目属、地表活动甲虫和芫菁科，半水生和水生昆虫属可能来自饮水或沼泽微栖息地觅食时的 incidental摄入。叶绿体分析显示Tyresta粪便以针叶树（松属平均84.4%）和杜鹃花科灌木（越橘属平均13.4%）为主，与挪威比较样本形成对比，季节性动态显示春季针叶树物种增加而浆果植物季节后期丰度更高。

讨论部分总结，本研究利用非损伤性样本的低覆盖度全基因组测序对Tyresta国家公园西部松鸡种群进行保护评估，结合基因组方法和宏基因组数据估计种群大小、评估遗传健康和结构、重建亲缘模式并详述食性习惯。研究发现该种群目前维持一定程度遗传稳健性但规模小且隔离，面临需要针对性保护管理的脆弱性。非损伤性基因组学的范围方面，确认脱落羽毛是高质量宿主DNA的优越来源，粪便样本虽对宿主基因组学效果较差但作为宏基因组DNA宝贵来源可了解食性，这种双重方法代表了对敏感物种全面监测的强大、经济有效且低干扰的工具包。一个小而韧性的种群处于遗传刀刃上，遗传捕获-重捕模拟估计种群大小约188只个体（95% CI=145–215），但多季节采样使严格封闭种群假设不太可能完全满足，该估计应解释为总丰度指数和研究期间近似上限，建立了关键数量级基线表明最大密度约3.25–4.65只/km2，确认Tyresta承载一个小且人口统计学脆弱的种群。尽管规模小，种群当前遗传健康似乎出奇健全，全基因组杂合度与其他大陆欧洲外群种群相当，近交水平相对较低，但少数个体具有极长ROH片段是近期近亲交配的信号，虽非系统性但此类事件可因小隔离种群中有限配偶可用性而发生，频率增加可能促使迅速陷入近交衰退。Tyresta种群因此处于遗传刀刃上，当前健康但具有未来风险的明确基因组指标。种群结构方面，PCA和mtDNA分析表明Tyresta松鸡作为单一族群功能，与J?mtland瑞典个体和欧洲种群遗传不同，雄性平均拥有略多亲属可能提示雌性偏倚扩散，这是鸟类常见模式，空间亲缘分析进一步支持这一观点。总体而言遗传数据显示相关雌性比相关雄性更靠近，与雄性在Tyresta内扩散距离更大一致，雌性可能是基因流的主要通道，保护策略必须优先考虑公园内栖息地及周围景观基质包括邻近地区求偶场，维持或创建功能性栖息地廊道促进扩散雌性安全通行可以说是确保Tyresta种群长期遗传力度的最关键行动。将食谱DNA与栖息地联系起来方面，关键植物物种如越橘、蓝莓、欧洲赤松和挪威云杉的鉴定重申成年松鸡对北方森林植物区系特征成分的依赖，叶绿体DNA季节性变化进一步突显食谱全年转变，针叶树芽和柔荑花序主要在春季消耗而浆果植物在季节后期占主导，这些模式与长期生态观察一致但提供了非损伤性直接分子证据。同样重要的是检测到大量无脊椎动物多样性跨越数十种甲虫、蛾、石蛾和其他分类群，松鸡雏鸟在生命最初几周几乎完全食虫，其存活和生长直接与无脊椎动物丰度相关，因此松鸡保护不能与无脊椎动物多样性保护分离。保护建议方面，尽管非损伤性采集样本通常遭受DNA降解、高环境污染物和低DNA浓度限制监测于靶向标记，本研究证明lcWGS可通过靶向采样结合低输入文库制备实现，通过解剖脱落羽毛的superior umbilicus和calamus基部捕获腋动脉有核血细胞残余最大化内源鸟类DNA恢复，工作流程利用超低输入文库制备方法（SPLAT方案）能够从低至0.001–100 ng输入DNA生成高质量测序文库而无需靶向富集，结合低覆盖度填补和低覆盖度生物信息学框架绕过高深度测序需求，展示了将非损伤性保护监测从标记面板过渡到全面全基因组评估的广泛适用且经济有效的模板。总之，Tyresta国家公园松鸡种群是一个小、隔离且高度互联的单元，目前保留足够遗传多样性但显示近交的基因组警告信号，其存续根本上与老龄森林栖息地完整性及其中丰富的生物多样性相联系，1999年大火对种群的长期影响仍然明显，因此必须将国家公园周围同样维持松鸡种群的栖息地纳入该地区松鸡长期管理，特别是保护求偶场和雏鸟存活关键环境免受集约林业影响。研究证明非损伤性采样工作在基因组尺度分析时可为该种群保护提供路线图。研究结论翻译：西部松鸡（*Tetrao urogallus*）作为北方森林专性物种，因栖息地丧失、破碎化及隔离，在瑞典南部出现显著种群下降。Tyresta国家公园及周边森林承载着该地区仅存的南部残余种群之一，然而其遗传健康、种群结构及食性生态学所知甚少。本研究对272份非损伤性采集样本（羽毛与粪便）进行低覆盖度全基因组测序（lcWGS），以全面评估该种群状况。羽毛样本产生了高质量基因组数据，可用于性别鉴定、全基因组杂合度估计、纯合子连续片段（ROH）分析及亲缘关系推断。Tyresta种群的杂合度水平与其他欧洲西部松鸡种群相当，近交水平总体较低，但若干个体表现出长ROH片段，提示近期存在近亲交配。种群结构分析揭示该种群为一个遗传上独特的隔离单元，并可能存在雌性偏倚的扩散模式。亲缘关系分析揭示了一个高度互联的社会网络，雄性平均拥有更多亲属。基于基因型匹配的重捕模拟估计当前最大种群规模为145–215只个体。粪便宏基因组分析揭示了多样化的食谱，包括蓝莓、越橘和桤木等关键植物物种，以及对雏鸟发育至关重要的多种无脊椎动物。尽管该种群目前遗传状况尚属稳健，但Tyresta种群规模小、隔离度高，面临近交衰退风险。保护工作应优先维持栖息地质量、促进基因流（如保护通往邻近种群的迁徙廊道），并确保丰富的森林无脊椎动物群落以支撑种群韧性。